论文部分内容阅读
目的:研究LPS诱导下COPD大鼠远端PASMCs合成分泌功能与其TLR4表达的时量、效量关系,并进一步探讨TLR4-IRAK-NF-κB信号通路对PASMCs合成分泌功能的改变及其调控机制,为早期防治COPD肺血管重塑提供行之有效的新的干预靶点。方法:实验分为两部分,第一部分:1.构建COPD大鼠模型,分离、培养、鉴定大鼠远端PASMCs;2.以COPD大鼠远端PASMCs为研究对象,随机分为2组:空白对照组和LPS组;3.各组PASMCs分别培养12h、24h、48h和72h后,蛋白质印迹（Western blotting）方法检测其TLR4蛋白表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测各组PASMCs上清液中IFN-γ、IL-6和PDGF-AB的含量。4.将LPS诱导下COPD大鼠PASMCs合成分泌因子的表达浓度与其TLR4表达量进行相关性分析。第二部分:探讨TLR4-IRAK-NF-κB信号通路是否调控LPS诱导下COPD大鼠远端PASMCs的合成分泌功能。首先,明确TLR4信号通路是否为LPS诱导下PASMCs合成分泌功能的主要调控途径,并明确其主要下游信号分子。分离、培养并鉴定COPD大鼠远端PASMCs设立实验组为:对照组、LPS组、TLR4抑制剂（TAK-242）组和LPS+TAK-242组;进行以下检测:（1）RT-PCR、Western blotting方法检测各实验组PASMCs中TLR4在基础状态和各种因素干扰时m RNA、蛋白表达水平;（2）Western blotting方法检测各组PASMCs中白介素-1型受体相关激酶（IRAK-1）、NF-κB抑制蛋白（IKBα）、NF-κB抑制物激酶α（IKKα）和NF-κB（p65）蛋白的表达水平;（3）ELISA方法检测各组PASMCs上清液中IFN-γ、IL-6和PDGF-AB的含量。其次,以IRAK1/4抑制剂和NF-κB抑制剂（BAY117082）为干预药物,进一步探讨TLR4诱导的IRAK1和NF-κB活化对LPS诱导下COPD大鼠PASMCs合成分泌功能的影响。以COPD大鼠PASMCs为研究对象,实验分组为:对照组、LPS组、IRAK1/4抑制剂组、LPS+IRAK1/4抑制剂组、NF-κB抑制剂组和LPS+NF-κB抑制剂组;共同培养48小时后收集细胞及细胞培养上清液进行以下检测:（1）Western blotting方法检测PASMCs中IRAK-1、NF-κB抑制蛋白（IKBα）、NF-κB抑制物激酶α（IKKα）和NF-κB（p65）蛋白表达水平;ELISA方法检测各组PASMCs上清液中IFN-γ、IL-6和PDGF-AB的含量。最后,将PASMCs中各蛋白表达量与其合成分泌因子表达的浓度进行相关性分析。结果:第一部分:1.与对照组相比,LPS诱导下COPD大鼠PASMCs中TLR4的表达量在12h开始上调,在48h达到高峰,72h后回落（P<0.05）;2.与对照组相比,LPS诱导COPD大鼠PASMCs合成分泌IFN-γ、IL-6和PDGF-AB含量在12h升高,在48h达到高峰,72h仍维持较高水平（P<0.05）。3.PASMCs上清液中IL-6、PDGF-AB和IFN-γ表达的浓度与其TLR4表达量呈显著正相关（见表2:在12h,r依次为0.975,0.928,0.976;在24h,r依次为0.98,0.984,0.876;在48h,r依次为0.937,0.998,0.962;在72h,r依次为0.925,0.991,0.933均有P<0.05）。第二部分:1.探讨TLR4信号通路对LPS诱导下COPD大鼠PASMCs合成分泌对调控作用及确立其下游信号通路中结果显示:（1）与对照组相比,LPS诱导COPD大鼠PASMCs可上调IRAK-1磷酸化蛋白、NF-κB蛋白表达及其IFN-γ、IL-6、PDGF-AB的含量（P<0.05）;（2）与LPS组相比,干扰TLR4后,可使PASMCs下调IRAK-1磷酸化蛋白、NF-κB蛋白表达及其IFN-γ、IL-6、PDGF-AB的含量（P<0.05）。2.以IRAK1/4抑制剂和NF-κB抑制剂（BAY117082）为干预药物探讨TLR4-IRAK-NF-κB信号通路的调控作用,结果显示:（1）与LPS组相比,予IRAK1/4抑制剂干扰IRAK-1活性后,可下调IRAK-1、IKKα、IKBα磷酸化蛋白、NF-κB蛋白表达及其IFN-γ、IL-6、PDGF-AB的含量（P<0.05）;予BAY117082干扰NF-κB活性后,可下调IKKα、IKBα磷酸化蛋白、NF-κB蛋白表达及其IFN-γ、IL-6、PDGF-AB的含量（P<0.05）;（3）根据相关性分析发现,PASMCs中各蛋白表达量与其细胞上清液中IL-6、PDGF-AB、IFN-γ表达浓度呈正相关（相关系数见表4,P均<0.05）。结论:1、LPS诱导下COPD大鼠远端PASMCs中TLR4表达量上调,同时合成分泌IFN-γ、IL-6和PDGF-AB升高,且二者间呈时效、量效正相关性。2、TLR4-IRAK-NF-κB信号通路参与LPS诱导下COPD大鼠远端PASMCs的合成分泌功能的调控,进而有可能影响COPD肺血管重塑。