植物雄性不育突变体是基因表达和遗传工程研究的优良材料,其表型特征有多种形式：雄性器官的萎缩、畸变或消失；不能形成正常的小孢子导致无花粉；小孢子异常形成不完善的、不能存活的败育花粉；有成熟花粉但花药不开裂；花粉在柱头上不能识别、萌发等。引起植物雄性不育的原因是多种多样的,其中激素与雄性不育的关系非常密切。一些激素控制的花粉发育缺陷、花药不开裂等雄性不育突变体被鉴定出来,它们大都和茉莉酸与生长素有关。本研究发现水稻花药不开裂与生长素密切相关,受生长素调控,故将基因命名为ANTHER INDEHISCENCE2(AID2)。吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)是植物中存在的生长素主要形式,它参与植物生长发育的几乎所有方面,包括细胞分裂、细胞伸长、细胞分化、植物向性、花器官发育和维管系统形成等。生长素主要在胚芽鞘,幼嫩的根尖、茎尖、叶片和未成熟种子等旺盛生长部位合成。当不同的发育过程需要生长素参与时,主要通过极性运输的方式输送到植物的各个部位发挥作用。然而,植物中积累过高的生长素对其本身的生长发育是不利的,往往会出现一系列不正常表型,其中花药不开裂的诱导便是其中一个方面。亚洲栽培稻和非洲栽培稻是世界上的两个主要栽培稻种,它们独立起源于不同的野生祖先种,但都具有相同的AA染色体组及相似的基因排列顺序。前人研究表明,其种间杂种在单株干重、单株茎蘖数上都有极显著的超亲优势。且非洲栽培稻中存在各类抗病虫、耐干旱、耐盐碱等优良基因。但由于杂种不育性,导致这种杂种优势及优良基因得不到实际应用。随着少数高产品种的大面积推广,水稻遗传基础变得越来越狭窄,产量徘徊不前。因此拓宽水稻遗传基础,特别是从近缘种中引入优良基因被认为是突破目前育种瓶颈的重要手段之一。开展水稻种间杂种不育基因的发掘、定位、克隆对于了解和克服杂种不育及杂种优势的利用具有重要的理论价值和实践意义。本论文分两个方面进行阐述。第一,通过辐射诱变水稻粳稻品种“日本晴”发现并鉴定了一个水稻花药不开裂突变体材料,进行了详细的细胞学分析并运用图位克隆方法分离了该基因,对其功能作了初步的研究。第二,利用了一个亚洲栽培稻与非洲栽培稻杂种花粉不育基因S19的近等基因系,通过次级分离群体,对S19进行了精细定位,同时对杂种花粉发育过程进行了细胞学观察。本论文的主要研究结果如下：1.通过对该水稻突变体aid2的形态观察和细胞学观察,发现突变体的主要特征是：株高、分蘖数等营养生长与野生型无异,抽穗期一致,花器官外观相同。但突变体抽穗后始终不开花,花药不开裂。通过对不同发育阶段的花药进行连续的半薄切片观察,发现突变体花药壁发育正常,绒毡层和中层能按时降解,但到花药开裂期四个药室保持分隔状态,无法完成开裂。成熟花粉能为12-KI染成黑色,表明淀粉积累正常。DAPI染色能观察到清晰的三核,扫描和透射电镜能观察到花粉粒正常的花粉壁、萌发孔和淀粉粒。花粉在体外培养基中不萌发,人为夹破突变体花药释放花粉粒到自身柱头上强制自交也观察不到花粉萌发迹象,表明虽然花粉能正常发育,但发育后不具备萌发能力。以突变体为母本辅助授以野生型花粉能使突变体恢复结实。故该突变体可视为一个以花药不开裂为主的雄性不育突变体,且不育特征表现为雄性功能缺失。2.对突变体/日本晴杂合植株的后代进行遗传分析,野生型表型和突变体表型符合3：1分离,表明由隐性单基因控制。在18000株突变体/Dular F2分离群体中选出突变体类型2100株,通过SSR标记和InDel标记最终将该基因定位在水稻第四染色体长臂52kb范围内。对定位区间测序并与公布的“日本晴”序列比对,发现在其中一个基因起始密码子后第24位碱基处缺失一个碱基C,造成翻译提前终止。经预测野生型编码300个氨基酸,而突变体仅编码48个氨基酸。因此将该基因列为候选基因进行转基因验证。将一段包含基因区和上游3.2k、下游1.6k,总长6083bp的野生型基因组片段克隆到双元载体pCAMBIA1305.1转化突变体愈伤组织,获得转基因阳性苗后,发现野生型基因能互补突变体表型。为了进一步确认候选基因,构建了基因第一外显子上272bp片段特异的干扰载体,转化野生型,获得的转基因阳性植株大都表现出不同程度的突变体表型。至此可以确认该候选基因的突变确实是造成突变表型的原因。3.雄性不育与激素联系密切。用不同类型、不同浓度的植物激素喷施野生型穗子,24h后只有生长素处理的穗子表现不同程度的不开花表型,其中以10-2M浓度IAA和10-4M浓度2,4-D处理效果最明显,但72h后恢复开花,表明高浓度的生长素的确能延迟水稻开花。通过对花药和子房IAA含量的测定,发现突变体花药和子房IAA含量均为野生型的3-4倍,即突变体花器官中积累了高浓度的生长素。将水稻生长素合成关键基因OsYUCCA1过表达野生型发现能诱导野生型转基因植株表现不开花、花药不开裂等表型。因此推断该突变体的雄性不育现象由生长素诱导。4.荧光定量PCR和promoter-GUS转基因水稻染色观察结果显示,该基因在各个部位均有表达,但在发育中后期的花药和受精后的子房中表达最高。将143-292位氨基酸作为抗原获得多克隆抗体,对野生型和突变体花药蛋白提取物进行Western-Blot分析,结果发现在目的蛋白大小处,野生型能看到清晰的条带,而突变体没有杂交信号,表明该蛋白在突变体中是功能缺失的。5.通过14C标记的蔗糖同位素示踪实验证实突变体花药和颖壳的放射量小于野生型,但突变体茎秆的三个节间放射量均大于野生型。用IAA喷施野生型穗子后,蔗糖的运输效率明显下降,花药和颖壳的放射量与突变体相近,节间亦然。表明高浓度的生长素能抑制蔗糖向花器官运输。对花药可溶性糖含量测定结果也表明突变体花药蔗糖、葡萄糖含量均低于野生型。通过对野生型和突变体浆片糖含量测定,发现突变体浆片中可溶性糖以蔗糖为主,且蔗糖和葡萄糖含量均明显比野生型低。突变体浆片渗透压也低于野生型。蔗糖是一种渗透压调节剂,因此突变体不开花表型是由浆片蔗糖含量低导致渗透压不足引起的。而浆片蔗糖含量低很可能也是由突变体蔗糖向花器官运输障碍引起的。6.通过利用以亚洲栽培稻的粳稻品种“滇粳优1号”为背景,非洲栽培稻为供体的近等基因系,并以近等基因系和“滇粳优1号”杂交的12,780株次级F2群体为研究目标,精细定位了一个引起水稻种间杂种花粉不育的基因S19,将S19定位在第三染色体短臂54kb范围内。研究发现,绝大多数携带粳稻基因型的花粉致死,造成了F1的花粉半不育现象,但不影响结实率。通过对花粉发育的细胞学观察表明,败育的花粉发育停留在二核期,且淀粉积累少,造成不育,而F1花药壁发育正常。