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自噬是细胞重要的生命过程,自噬过程中,胞质中出现双层膜结构以包裹长寿命蛋白和细胞器,形成自噬小体(Autophagosome).之后自噬小体与溶酶体融合成为自噬溶酶体(autolysosome),对其所包裹的内容物进行降解,最后自噬体膜脱落再循环利用。自噬对细胞的能量循环、代谢、细胞器的更新及维持细胞内稳态有非常重要的作用。本课题组研究发现,采用蛋白酶体抑制剂和自噬诱导剂雷帕霉素处理肿瘤细胞后,能够募集富含短寿蛋白(Defective ribosomal products, DRiPs)[1]的自噬小体,本课题组将其命名为DRibbles(DRip in Blebs).实验发现,DRibbles中包含肿瘤细胞的全部抗原信息,并且含有多种DAMP分子(HSPs, carlreticulin, HMGB1等)可以作为抗原交叉递呈的物质基础。肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一,在抗肿瘤免疫应答中,机体T细胞参与的免疫应答在杀伤肿瘤细胞、控制肿瘤生长中起重要作用。但往往肿瘤细胞与靶细胞相互识别机制中的重要信号分子如抗原、共刺激分子和MHC分子通常低表达或不表达,因此肿瘤细胞必需依赖专职抗原递呈细胞来递呈肿瘤抗原,以此来刺激抗原特异性CD8+T细胞应答,发挥抗肿瘤免疫应答功能。除了树突状细胞(Dendritic cells, DCs)外,B细胞也是机体内重要的抗原递呈细胞(APCs)。与DCs相比,B细胞在体内数量多,均一性好,越来越受到科学家们的关注,并且已有研究表明,B细胞在机体的抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。然而,目前的研究显示静息B细胞不仅无法激活初始T细胞(Naive Tcells),反而会使其失活。而通过CD40分子刺激活化B细胞(CD40活化B细胞)一直是研究的重点。有研究表明,CD40活化B细胞负载各种抗原后(短肽、肿瘤细胞裂解液、或逆转录病毒/RNA转染抗原、病毒抗原,与肿瘤细胞克隆融合等)能在体外诱导激活抗原特异性初始CD4+T细胞和CD8+T细胞应答[3]。体外实验表明TLR9刺激剂(CpG oligodeoxynucleotide [ODN])能够增强B细胞表面MHCⅠ类分子和共刺激分子CD86的表达,增强B细胞内吞活性。本课题组前期实验结果表明：DRibbles中包含的肿瘤抗原能够以TLR2-MYD88依赖方式活化B细胞,并且活化的B细胞能够交叉递呈DRibbles抗原,诱导机体内效应T细胞再次应答。那么本实验进一步对B细胞负载DRibbles抗原后能否诱导初始T细胞免疫应答及其机制进行探讨,同时研究B/DRibbles疫苗是否具有抗肿瘤作用,以及联合CpG与抗CD40抗体的B/DRibbles疫苗的抗肿瘤作用的研究。目的：1、探讨B细胞负载DRibbles抗原是否能够诱导初始T细胞应答并产生抗肿作用。2、探讨联合CpG和抗CD40抗体能否进一步增强B/DRibbles疫苗的抗肿瘤作用。方法：1 B细胞负载DRibbles抗原是否能够诱导初始T细胞应答并产生抗肿瘤作用的检测：1.1采用OT-I小鼠的淋巴结细胞作为naive T细胞,体外与单独DRibbles(OVA+)、未负载DRibbles的B细胞、负载DRibbles(OVA+)或肿瘤细胞裂解液的小鼠B细胞、负载DRibbles(OVA+)的DC共孵育5天,采用流式细胞仪检测CFSE标记的OT-I naive T细胞的增殖情况。1.2建立C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型,分别用PBS、B细胞、B/DRibbles三次免疫小鼠,同时过继转移或不过继转移OT-I细胞,观察肿瘤生长并统计小鼠生存期限。1.3首次免疫治疗后第10天处死部分小鼠,收集脾脏和淋巴结细胞,使用流式细胞仪检测Vβ5.1/5.2+CD8+OT-I T细胞比例,体外加肿瘤抗原再刺激,72小时后收集培养上清,ELISA法检测上清中IFN-γ水平。2联合抗CD40抗体和CpG增强的B/DRibbles疫苗的抗肿瘤作用的检测：2.1纯化B细胞与DRibbles(OVA+)、DRibbles(OVA+)联合CpG与抗CD40抗体共同孵育3天后,流式细胞仪检测B细胞表面MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD86分子表达情况；2.2建立C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型,分别用PBS、CpG与抗CD40抗体预处理的B细胞、CpG与抗CD40抗体增强的B/DRibbles三次免疫小鼠,观察肿瘤生长并统计小鼠生存期限；2.3首次免疫治疗后第10天处死部分小鼠,收集脾脏和淋巴结细胞,体外加EG7肿瘤细胞来源DRibbles、无关的B16肿瘤细胞来源DRibbles以及抗CD3抗体再刺激,72小时收集培养上清,ELISA法检测上清中IFN-y水平。结果：1 B细胞负载DRibbles抗原是否能够诱导初始T细胞应答并产生抗肿瘤作用的检测：1.1体外负载DRibbles(OVA+)的B细胞能够交叉递呈DRibbles抗原诱导OT-InaiveT细胞的增殖,增殖幅度明显高于单独DRibbles组(32.2% vs 1.1%)、单独B细胞组(32.2% vs 7.6%)及B细胞负载肿瘤细胞裂解液组(32.2% vs10.3%)。1.2建立C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型,与PBS组相比,B/DRibbles疫苗三次免疫小鼠,若同时过继转移OT-I细胞,荷瘤小鼠肿瘤完全消退,小鼠正常生存,生存率为100%,中位生存期明显延长(>84天vs 28天)：若未过继转移OT-I细胞,荷瘤小鼠肿瘤生长延缓,中位生存时间延长(43天vs 21天)。1.3用B/DRibbles疫苗免疫荷瘤小鼠能够活化小鼠体内初始T细胞应答诱导效应T细胞产生。过继转移OT-I细胞的小鼠模型中,B/DRibbles疫苗三次免疫组与PBS组相比,小鼠体内OT-I细胞增殖明显(2.3% vs4.5%),细胞上清中IFN-γ水平也明显升高(3100pg/ml vs 100pg/ml)。野生型小鼠模型中,小鼠脾细胞经EG7 DRibbles刺激后同样能够产生较高水平的IFN-y (370pg/ml vs 20pg/m1)。2 联合抗CD40抗体和CpG增强的B/DRibbles疫苗的抗肿瘤作用的检测：2.1 CpG与抗CD40抗体联合DRibbles(OVA+)能够刺激B细胞表面MHCI类分子(98.6% vs 12,7%)、MHC Ⅱ类分子(84.8%/290 vs 92.3%/1210)、CD86分子(16% vs 54.8%)的表达进一步升高,明显高于CM组。2.2建立C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型,使用抗CD40抗体和CpG优化的B/DRibbles疫苗对荷瘤小鼠进行三次免疫后,荷瘤小鼠肿瘤生长进一步延缓,与B/DRibbles疫苗组相比,中位生存时间进一步延长(45天vs 42天)。2.3抗CD40抗体和CpG增强的B/DRibbles疫苗能引起小鼠体内高水平的效应T细胞应答,小鼠体内脾细胞体外经EG7 DRibbles刺激后能够产生高水平的IFN-γ,与PBS组相比明显升高(1700pg/ml vs 350pg/ml),同时明显高于B/DRibbles组(1700pg/ml vs 1000pg/ml)。结论：1.B细胞负载DRibbles抗原后能够在体外诱导初始T细胞活化并且B/DRibbles疫苗能够诱导初始T细胞免疫应答,并产生抗肿瘤效应。2.联合Cp6和抗CD40抗体能够进一步加强B/DRibbles疫苗的抗肿瘤作用。