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鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)是一种革兰氏阴性条件致病菌,广泛存在自然界及医院中,可以引起肺炎、脑膜炎等细菌感染疾病。随着细菌耐药性的日趋严重,目前已经出现了多重耐药不动杆菌、泛耐药不动杆菌以及全耐药不动杆菌。我国已经颁布了禁用抗生素和限用抗生素的政策,寻找新的抗菌药物迫在眉睫。噬菌体裂解酶是噬菌体在侵染宿主后期为了释放子代噬菌体产生的一种细胞壁水解酶,相比于传统的抗生素治疗及噬菌体治疗,噬菌体裂解酶治疗细菌感染具有其独特的优势,例如不易产生耐药性、特异性更高、相对特异性等等。噬菌体裂解酶作为一种新型的生物抗菌药物,以其优异的抗菌效果日益受到研究者的青睐。革兰氏阴性细菌相比于革兰氏阳性细菌多了一层由脂多糖构成的细胞外膜。由于这层外膜的存在,仅有少数裂解酶能在不添加外膜渗透剂的情况下对鲍曼不动杆菌产生裂解作用。革兰氏阴性细菌裂解酶与革兰氏阳性细菌裂解酶相比,往往需要的剂量更大,作用的时间更长。裂解酶PlyAB1是在鲍曼不动杆菌AB1的噬菌体abpl中分离得到的。我们以该酶为研究对象,首先对其进行了异源表达、诱导条件的摸索和基本酶学性质的检测。确定了其诱导表达条件是温度16℃,IPTG终浓度是0.5 mM,诱导时间是20 h。利用裂解曲线及点板法测定了其裂解活性,通过热稳定性实验,确定了其在20℃-45℃保持稳定。当用EDTA预处理指示菌的时候,PlyAB1对很多革兰氏阴性细菌都表现出裂解活性,包括有大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21(DE3)、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌和鲍曼不动杆菌。在了解PlyAB1的基本酶学性质后,我们进一步利用蛋白质工程改造对其进行了性质上的优化。一方面,本研究通过蛋白质半理性设计的方式得到裂解活性提高的突变体。通过对两个来源于鲍曼不动杆菌的裂解酶PlyAB1与LysAB2进行异源表达及酶活检测,发现二者酶活相差近一半,但在氨基酸组成上仅有5个氨基酸位点的不同。于是我们以PlyAB1为出发点设计了 E33A,S41T,E96K,G100E,S103G五个突变体,结果发现突变体G100E酶活下降明显。基于此我们推测PlyAB1的第100位氨基酸是影响酶活的关键氨基酸。为了进一步验证此观点,随后对该位点进行了饱和突变,结果得到了一些酶活提高的突变体,其中突变体G100Q酶活提高了 39%,进一步证明第100位氨基酸是影响酶活的关键氨基酸。分析实验结果不难发现,当突变后的氨基酸为酸性氨基酸时,酶活下降;当突变后的氨基酸为碱性氨基酸时,酶活提高。另一方面,蛋白质的热稳定性也会影响日后生产应用过程的储存及配方,本研究利用蛋白质理性设计的方式,即通过蛋白质三维结构模拟、分子动力学模拟、保守结构域分析和软件预测得到了几个可能提高热稳定性的突变体,通过对这些突变体进行构建、表达及稳定性检测,最终得到了热稳定分别提高50%和150%的突变体K69R和P84A。随后我们进行组合突变,得到在50℃条件下酶活分别提高 172%和 95%的组合突变体 G100R/K69R和 G100K/K69R,其中 G100R/K69R突变体半衰期由原来的0.5 h提高到了 12.5 h。本研究初步尝试裂解酶的融合方法,将裂解酶PlyAB1与溶葡萄球菌酶进行融合,得到了裂解谱扩大的融合裂解酶Lysostaphin-GGGS-AB1。综上所述,本文利用大肠杆菌表达体系,高效表达了可溶性裂解酶PlyAB1,发现其对多种革兰氏阴性细菌均有裂解活性,为裂解酶的临床抗菌应用提供了可能。本文利用蛋白质半理性设计和理性设计相结合的方法得到了裂解活性和热稳定性提高的突变体;初步探究了裂解酶与革兰氏阴性细菌作用的可能机制和构建融合裂解酶的方式,为实验室进一步做相关研究奠定了基础。