痘苗病毒(Vaccinia virus,VACV)早期作为天花疫苗在人类消灭天花的战役中起到关键的作用,人类成功消灭天花后,痘苗病毒被引入实验室中作为基因表达载体被广泛用于多种感染性疾病以及癌症的预防和治疗。由于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染以及癌症治疗和器官移植等医疗过程中需要进行免疫抑制,使痘苗病毒的安全性受到挑战。为了提高痘苗病毒载体的安全性,研究人员对痘苗病毒野毒株进行改造,获得了在多数人源细胞中无法有效复制的毒株,即复制缺陷型痘苗病毒。目前国际上常用的复制缺陷型痘苗病毒株有:修饰的痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Ankara,MVA)、减毒的痘苗病毒哥本哈根株NYVAC和我国的痘苗病毒天坛株(Vaccinia Virus Tiantan,VTT)的衍生株-复制缺陷型痘苗病毒天坛株(Non-replication Tiantan Vaccinia Virus,NTV)。其中 MVA 和 NYVAC的生物生物学特性和复制缺陷机制已经研究的十分清楚,而NTV的复制缺陷机制了解甚少。本研究从NTV细胞的生物学特性入手,研究病毒的复制能力、细胞嗜性及其毒力,并对病毒功能蛋白表达水平和对应mRNA转录水平、病毒感染细胞中eIF2α磷酸化水平和PARP裂解物等进行检测,对NTV复制缺陷可能存在的机制作了初步的探究,为未来NTV作为疫苗载体的安全使用以及载体的进一步改造提供数据支持。主要研究内容和结果如下:1、制备痘苗病毒复制密切相关蛋白的多抗血清:用原核表达系统高效表达了痘苗病毒早期蛋白E3和晚期蛋白A17、F17,经His-Bind亲和层析柱或切胶纯化获得了纯化的目的蛋白,蛋白纯度均达到90%;免疫小鼠获得了相应的鼠多抗血清,为检测痘苗病毒的蛋白表达水平提供了特异性抗体。2、NTV 的细胞生物学特性:在 CEF、BHK-21、Vero、143TK-、HeLa、2BS、和Hep-2细胞系中检测病毒的在细胞中的复制能力和细胞间的扩散能力,结果发现NTV的母毒株VTT在上述细胞中均能够形成明显的噬斑并且可以产生高低度的子代病毒,而NTV仅可在CEF、BHK-21两种细胞系中形成噬斑,病毒的复制能力与VTT相当。但是在人源细胞143TK-、HeLa、2BS、Hep-2以及Vero上无法形成噬斑,不能有效复制和扩散。因此,NTV在大部分人源细胞和其他动物细胞中的复制能力减弱或者复制受阻,无法有效复制。3、NTV复制缺陷机制的初步探究主要通过对病毒蛋白的表达水平、转录水平及病毒感染的细胞中eIF2α磷酸化水平和PARP裂解产物的检测来分析。NTV早期蛋白E3和晚期蛋白A17/A27/F17在允许细胞BHK-21表达水平与VTT无统计学差异,可正常表达。在非允许细胞HeLa中,NTV的E3和A27蛋白与VTT比能正常表达,而晚期蛋白A17和F17的表达明显受阻;为了分析蛋白受阻的原因,对NTV在非允许细胞中的转录水平和eIF2α磷酸化水平进行了检测,结果表明NTV和VTT感染HeLa细胞同一时间点的A27/A17/F17蛋白的转录水平无统计学差异,并且NTV感染的细胞eIF2α磷酸化水平升高,我们判断蛋白表达受阻发生在蛋白的翻译阶段。NTV感染的HeLa细胞中凋亡标志因子PARP裂解产物的检测结果表明NTV感染的细胞中有大量的PARP裂解产物,而VTT感染的细胞中仅有微弱的PARP裂解产物,说明NTV感染的HeLa细胞引发了细胞凋亡,而细胞发生凋亡会直接限制病毒的复制增殖。总之,本文研究通过对NTV在不同种属和组织来源的细胞上的复制能力、细胞嗜性,诱发的细胞病变进行测定,发现NTV在大多数哺乳动物细胞中无法有效复制;用制备的痘苗病毒早期蛋白E3和晚期蛋白A17、F17、A27鼠多抗检测了 NTV在HeLa细胞中相应早、晚期蛋白的表达水平;结果显示NTV在非允许细胞HeLa中晚期蛋白A17和F17表达受到抑制,并且抑制发生在蛋白翻译阶段。同时研究发现NTV感染的细胞可检测到PARP的裂解产物,说明NTV感染后期诱发了细胞凋亡。因此,由以上结果我们分析初步得出结论:NTV的复制缺陷机制可能与晚期蛋白A17和F17翻译水平受阻和细胞凋亡有关。