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体外受精-胚胎移植技术在不孕症治疗中发挥着越来越重要的作用。但是胚胎低着床率仍然是技术的瓶颈,提高临床受孕率是目前理论及技术研究的热点之一。胚胎成功着床取决于母体子宫内膜和胚胎两方面因素。胚胎方面,TB的生物学功能和行为是关键性作用。CsA是用于器官移植和自身免疫疾病的免疫抑制药物,促进多种肿瘤细胞和非肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖功能。对人类早期妊娠研究证实,CsA在诱导母体对胚胎抗原产生免疫耐受的同时,促进妊娠50-60天的绒毛TB增生和侵袭,减少其凋亡；在小鼠流产模型中观察到,CsA降低CBA/JxDBA/2小鼠的胚胎吸收率。进一步研究证明,CsA主要与环亲素结合,通过MAPK3/MAPK1/AP1信号通路及Ca2+/calcineurin/NFAT信号传导路径发挥作用。胚胎与子宫内膜的发育同步是胚胎被子宫内膜接受和成功着床的先决条件。关于CsA对胚胎的作用我们尚不清楚：CsA是否通过改善围着床胚胎TB的功能,提高胚胎着床率,从而有利于IVF-ET? CsA是否对植入前胚胎的发育构成影响,改变胚胎发育速度而影响胚胎着床?本课题通过以小鼠胚胎为模型,进行体外实验,研究CsA调节着床前小鼠胚胎发育与分化、胚胎粘附与侵袭的分子机制,以探索CsA对胚胎及其着床的影响。第一部分环孢素A对孵出前胚胎细胞增殖、凋亡、分化和囊胚形成的调节作用[目的]以小鼠为模型,探讨CsA对孵出前胚胎的细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化和BC形成的调节作用。[方法]①应用含浓度为0、0.1、1.0和CsA的培养液培养小鼠2dpc胚胎,收集4dpc胚胎观察细胞分化,应用DAPI对全胚胎细胞核染色,应用免疫荧光对ICM细胞染色,计算TB和cICM,以判断BC细胞分化及细胞群落分布；②收集5dpc小鼠胚胎经Hocehst 33258荧光染色后计数胚胎细胞数量,观察BC形成；用TUNEL染色法,在荧光显微镜下计数凋亡细胞。采用RT-PCR技术,分析不同浓度CsA对4dpc小鼠胚胎CDX2和Oct4 mRNA转录的影响。[结果]2754枚2dpc小鼠胚胎分为4组,分别经含浓度为0、0.1、1和10μMCsA培养液培养。到5dpc BC形成率分别为68.1%(n=689)、67.5%(n=682)、66.4%(n=693)和68.4(n=690),各组间无显著性差异(p>0.05)。取2dpc胚胎经浓度为0、0.1、1和lOpM CsA的培养液培养到5dpc后,获得175枚3期及以上BC用于细胞计数。各组每胚胎的细胞数为91.1±3.2(n=34)、 82.9±2.1(n=47)、88.5±3.0(n=45)和93.3±2.9(n=49),各组间没有显著性差异(P>0.05)。取2dpc胚胎经浓度为0、0.1、1和10μM CsA的培养液培养到4dpc后,获得154枚3期及以上BC用于cICM和TB计数(0、0.1、1和10μM组分别有胚胎47、36、39和32)。各组每胚胎cICM数分别为10.6±0.5、12.3±0.7、12.3±0.6和12.2±0.7,TB数分别为38.6±1.3、40.5±1.8、42.1±1.9和45.0±2.7。各组问的cICM和TB没有显著性差异(P>0.05)。以对照组(0μM组)的表达量为“1”,0、0.1、1和10μM CsA组的Oct4mRNA的转录分别为1.00±0.07、1.42±0.08、1.63±0.18和0.60±-0.07。1.0组显著高于其他各组(P<0.05),但当CsA超过10μM时表达下调(P<0.001)；CDX2mRNA的转录分别为1.00±0.24、1.10±0.13、1.14±0.22和0.77±0.17,各组间无显著性差异(P>0.05)。取2dpc胚胎经浓度为0、0.1、1和10μM CsA的培养液培养到5dpc后,获得97枚3期BC用TUNEL染色后计数凋亡细胞。0、0.1、1和10μM组胚胎的细胞凋亡指数(%)分别为4.51±0.30、5.14±0.17、5.56±0.23和3.79±0.12。各组间无显著性差异(p>0.05)。[结论]由以上结果我们得出以下结论：1.在0.1-10μM浓度下,CsA在体外对5dpc小鼠BC形成和凋亡没有显著性影响。2.在0.1-10μM浓度下,CsA在体外对小鼠体外BC的细胞总数量(5dpc)、TB和cICM(4dpc)数量没有影响。3.在0.1-1.0μM浓度下,CsA明显上调cICM Oct4 mRNA的转录,但达到10gM后出现下调；对TB特异分子CDX2的mRNA转录没有显著影响。第二部分环孢素A调节小鼠囊胚孵出和着床能力的分子机制[目的]探索CsA对胚胎孵出和着床能力的调节和机制。[方法]①将小鼠2dpc胚胎培养到4dpc后,取出BC在浓度为0、0.1、1.0和10μM CsA的培养液培养到6dpc,观察BC的孵出率,用RT-PCR检测关键酶ISP1mRNA的转录水平；②将小鼠2dpc胚胎培养到5dpc后,取出孵出的BC用浓度为0、0.1、1.0和10μM CsA的培养液、LN包被的培养皿培养,在7dpc和8dpc分别观察胚胎粘附率和测量伸展生长的面积。并应用qRT-PR检测itgβ3和MMP-9mRNA转录水平,并应用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜观察其蛋白表达。[结果]799个胚胎用于观察胚胎孵出。0、0.1、1.0和IOμM CsA组的BC孵出率分别为90.15%(n=203)、89.57%(n=211)、96.25%(n=186)和95.98%(n=199),P>0.05。以对照组(0μM组)的表达量为“1”,0、0.1、1和10μMCsA组的ISP1 mRNA的转录分别为1.00±0.31、0.68±0.13、0.73±0.18和1.01±0.33,各组间没有显著差异(P>0.05)。360个胚胎用于观察胚胎的粘附。0、0.1、1和10μM CsA组的粘附率分别为76.0%(n=79)、91.8%(n=97)、93.8%(n=80)和83.7%(n=104),0.1和1.0μM组明显高于对照组(P<0.01)。]26个粘附胚胎用于测量伸展面积。0、0.1、1和1OμM CsA组的胚胎伸展生长面积(×104μm2)分别为4.14±0.39(n=29)、4.32±0.37(n=34)、5.76±0.37(n=34)和4.83±0.34(n=29)。1μM组明显高于对照组(P<0.05)。以对照组(0μM组)的表达量为“1”,0、0.1、1和10μM CsA组的itgβ3 mRNA的转录分别为1.00±0.07、0.51±0.09、1.98±0.0.29和0.76±0.08,1μM组明显高于对照组(P<0.05)。MMP-9 mRNA的转录分别为1.00±0.15、1.44±0.18、2.37±0.18和1.68±0.21,0.1和1州组明显高于对照组(P<0.05)。免疫荧光显示,itgβ3和MMP-9蛋白表达上调。[结论]由以上结果我们得出以下结论：1.CsA不影响胚胎的孵出及关键酶ISP1 mRNA的表达。2.胚胎孵出后,CsA在0.1和1.0μM浓度下明显提高BC对LN的粘附；1.0μM浓度下促进胚胎在LN上的伸展生长；其作用的分子机制可能与TB的整合素αvβ3和MMP-9在mRNA转录和蛋白表达上调有关。小结1.在0.1-10μM浓度的CsA下,CsA不影响孵出前胚胎的发育进程,包括细胞增殖、凋亡、BC形成不受影响,cICM和TB的分化不受影响。TB的CDX2表达不受影响,但cICM的Oct4表达受到上调。2.CsA可能通过上调整合素αvβ3的表达,上调胚胎粘附和迁移的功能；通过上调MM-9的表达,改善胚胎裂解ECM的功能,从而使胚胎TB的侵袭能力提高,有利于胚胎的着床。