全球暖化是严重的环境问题之一，其主要原因是大气中二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)和一氧化二氮(N2O)等温室气体浓度的不断增加。甲烷是一种强烈的温室气体，虽然甲烷在空气中的含量低于二氧化碳，但是甲烷造成全球暖化的影响作用是二氧化碳的20～30倍。饲料在反刍动物瘤胃内被各种微生物发酵产生的甲烷不能被动物利用，而是以嗳气的方式排出体外，这不仅会加剧温室效应，而且还会造成2-15％饲料总能量的损失。因此，采取措施减少动物源甲烷的排放将有助于缓解全球气候变暖，同时还可以降低瘤胃发酵的能量损失，提高饲料利用率。近几十年来，由于抗生素等饲料添加剂的广泛使用严重危害畜禽和人类健康，植物提取物作为一种抗生素替代品在畜禽养殖上越来越受到重视。很多研究者发现，皂甙类物质具有调节瘤胃微生物发酵、抑制原虫数量、降低甲烷产量等作用。但是，这些研究都基于短期的在体试验或体外发酵试验的结果，皂甙对甲烷生成的抑制作用是否能长期存在，是否具有作为绿色添加剂长期开发利用的价值尚未清楚。此外，研究还发现皂甙对甲烷生成的抑制作用与日粮精粗比有关，尽管这方面的报道结果并不一致。为此，本论文首先通过体外试验研究不同精粗比条件下绞股蓝皂甙对甲烷生成的抑制作用。其次，在该研究的基础上，通过长期瘤胃灌注绞股蓝皂甙，研究其对瘤胃甲烷生成、发酵特性及菌群作用的时间效应。最后，通过体外多次传代试验，对绞股蓝皂甙抑制甲烷生成的作用机制和瘤胃菌群对绞股蓝皂甙的耐受性进行进一步探讨。　　1不同精粗比条件下添加绞股蓝皂甙对瘤胃体外甲烷生成、发酵特性及微生物区系和数量的影响　　本试验以羊草、玉米和豆粕的混合物为底物，采用体外产气量法研究不同精粗比条件下，绞股蓝皂甙对甲烷产量、发酵特性及微生物区系和数量的影响。试验采用2×2双因子试验设计，即2个底物精粗比(玉米和豆粕∶羊草=70∶30和30∶70）和2个绞股蓝皂甙添加量（0mg和16mg）。瘤胃液取自3只安装有永久性瘤胃瘘管的南京本地山羊。发酵2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h时，测定产气量和甲烷的产量，并在发酵48h后采集发酵液样品测定瘤胃发酵参数和微生物。结果显示，发酵过程中高粗料组的产气量和甲烷产量均极显著低于高精料组(P＜0.01)。高粗料底物条件下添加绞股蓝皂甙显著降低了48h的累计产气量和甲烷产量，使甲烷产量降低了14.49％。但高精料底物条件下皂甙处理组和对照组之间甲烷产量和产气量均没有差异。不同精粗比条件下，添加绞股蓝皂甙均提高了发酵液的pH值，尤其是高粗料底物条件下差异显著（P＜0.05），但对氨态氮和微生物蛋白浓度没有显著影响。高精料底物条件下，发酵液中的各种挥发性脂肪酸的浓度在皂甙处理组和对照之间的差异不显著。然而，在高粗料底物条件下，添加绞股蓝皂甙显著降低了发酵液乙酸浓度和略提高了丙酸浓度从而使乙酸/丙酸比例显著降低（P＜0.05）。两种不同精粗比条件下添加皂甙均显著提高了发酵液丁酸的浓度。DGGE结果显示，与高粗料组相比，高精料底物条件下，细菌和原虫DGGE图谱上的有些条带消失，而甲烷菌DGGE图谱上多了一些条带。但是，在不同精粗比条件下，添加绞股蓝皂甙对于瘤胃总细菌、原虫和产甲烷菌的区系结构没有明显的影响，无差异性条带出现。定量PCR结果显示，发酵体系中精粗比的改变显著影响了黄化瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、真菌和原虫的数量（P＜0.05），但对甲烷菌和总细菌数量没有明显的作用。高粗料底物条件下，皂甙处理组琥珀酸丝状杆菌和原虫数量显著降低(P＜0.05)，而甲烷菌的mcrA基因数量（P＜0.10）及总细菌、真菌和黄花瘤胃球菌数量均具有下降的趋势。与对照组相比，高精料底物条件下，添加绞股蓝皂甙对这些微生物的数量均没有影响。以上的结果说明，绞股蓝皂甙在高粗料底物条件下，通过抑制瘤胃中原虫、甲烷菌及纤维降解茵等各种微生物的数量来降低甲烷的产量。但是，在高粗料底物条件下添加绞股蓝皂甙对甲烷产量及相关的微生物数量和区系没有任何影响。　　2瘤胃灌注绞股蓝皂甙对山羊甲烷生成、瘤胃发酵特性及微生物生态变化的时间效应和血液指标的影响　　本试验通过山羊瘤胃内长期灌注绞股蓝皂甙研究绞股蓝皂甙对瘤胃甲烷生成、发酵特性及微生物生态的长期效应。8头安装有瘤胃瘘管的1岁左右本地山羊采用2×2交叉设计分成两组。绞股蓝皂甙每天的灌胃量为:对照组0g/天/头，处理组6g/天/头。试验共两期，每期分5个阶段，包括一个21天的基础日粮适应阶段（第二期为交换阶段）和四个21天的试验阶段。以绞股蓝皂甙灌注量与不同阶段作为主要因子，研究瘤胃灌注绞股蓝皂甙对瘤胃甲烷生成、发酵特性及微生物的影响。将绞股蓝皂甙在60mL生理盐水中混匀，分两次在8:00和17:00点从瘘管处灌注到瘤胃里，对照组灌注相同体积的生理盐水。日粮以山羊维持需要量配制，精粗比为3:7。从每阶段的第十四天开始，用INNOVA1412红外光声谱气体监测仪和INNOVA1309多点采样仪测定甲烷产量。每三天记录一次剩余料量来计算采食量，每阶段的最后两天分别在晨饲前的0h和饲喂后2h、4h、8h，利用负压原理抽取瘤胃内容物测定各种指标。每一期结束后，于次日采食前0h在山羊右颈静脉采血测定血清指标。结果显示，添加绞股蓝皂甙对不同阶段山羊干物质采食量没有显著的影响。与对照组相比，甲烷排放量在阶段1和2分别降低了6.08％和6.76％(P＜0.05)，但是在最后两个阶段逐渐上升。整个试验期，绞股蓝皂甙对瘤胃pH值、微生物蛋白没有明显的影响。但处理组的氨态氮浓度从第一阶段开始逐渐降低的趋势（P＜0.10）。此外，丁酸、戊酸和异戊酸浓度也没有发生显著变化。但是，处理组各阶段丙酸浓度略高于对照组。处理组的乙酸浓度在试验的第一阶段和第二阶段显著低于对照组（P＜0.05），而且在这两个阶段，乙酸/丙酸比例和总挥发性脂肪酸浓度也显著降低（P＜0.05），然而在第三和第四阶段又恢复到基础阶段的水平。皂甙处理后异丁酸浓度降低，尤其第一阶段差异显著（P＜0.05）。瘤胃灌注绞股蓝皂甙对于瘤胃总细菌、产甲烷菌和原虫的区系结构没有明显的影响，DGGE图谱上没有差异性条带出现。定量PCR结果中甲烷菌的mcrA基因数量和原虫数量具有与甲烷产量相同的变化趋势。与对照组相比，处理组甲烷菌的mcrA基因数量在第一阶段和第二阶段分别低于22.4％和28.04％(P＜0.10)，而处理组的原虫数量在第一、第二阶段分别降低14.7％和12.3％(P＜0.10)，但在试验的第三和第四阶段逐渐恢复到处理前的水平甚至更高。各阶段处理组的总细菌、真菌、黄化瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌的数量均低于对照组，但可能因为个体差异导致较大的标准误差，以上微生物在处理组与对照之间的差异没有达到显著的水平。瘤胃灌注绞股蓝皂甙对血液总蛋白、总胆固醇、血糖、尿素氮、肌酐的浓度，以及谷草转氨酶、谷酰转肽酶和乳酸脱氢酶的酶活无显著影响，说明长期灌胃绞股蓝皂甙对山羊的健康没有影响。总而言之，绞股蓝皂甙通过抑制瘤胃中的各种微生物数量降低瘤胃内甲烷的产量，而且对动物的健康没有负面影响，但是，在长期使用绞股蓝皂甙时这种抑制作用逐渐消失，可能的原因是微生物对皂甙产生耐受。　　3添加不同水平的绞股蓝皂甙对传代培养中甲烷生成、发酵参数和重要微生物区系和数量的影响　　本试验采用体外多次传代培养及产气量法，体外研究不同水平的绞股蓝皂甙对瘤胃甲烷生成、发酵特性及微生物区系和数量变化的影响。试验根据绞股蓝皂甙的添加量（0、8、16和24mg/100mL）分为4组。发酵瓶中的底物为羊草、玉米与豆粕（分别为羊草0.70g、玉米0.20g和豆粕0.10g）。第一代接种物为山羊晨饲前采的10mL用4层纱布过滤的瘤胃液，后面的每代接种物依次为上代的发酵液，每次均取10mL添加皂甙前传5代使微生物处于稳定期，添加绞股蓝皂甙后再传5代。每个处理组设4个重复，每48h进行一次传代，每次传代后的12h、24h和48h测定产气量和甲烷产量。每代发酵结束后迅速测定pH值，然后采集发酵液样品测定相关指标。结果显示，绞股蓝皂甙能有效地抑制甲烷产量。发酵48h高剂量组（16mg和24mg）的累计产气量和甲烷产量在第二、第三、第四代显著低于对照组(P＜0.05)，而且，皂甙剂量间呈显著和极显著的线性效应（P＜0.05、P＜0.01）。整个发酵期，各处理组48h的累计产气量与甲烷产量呈先降低后上升的趋势。高剂量处理组（16mg和24mg）48h甲烷产量在发酵的第三代分别比对照组降低了27.70％和31.08％（最低时）差异显著(P＜0.05)，而第五代分别降低11.91％和13.10％，但差异不显著(P＞0.05)。经过5代发酵，各处理组的pH值均高于对照组或相当，但各组之间差异不显著。除了16mg和24mg处理组氨态氮浓度在第三和第五代之间显著的代次差异外(P＜0.01)，氨态氮和微生物蛋白浓度各处理组和对照组之间没有显著差异。发酵的前四代各处理组总挥发性脂肪酸浓度均低于对照组，但各组之间的差异不显著(P＞0.05)，第三、第四代皂甙剂量之间有显著的线性效应(P＜0.05)。在培养每一代各处理组的乙酸浓度均低于对照组，尤其是高剂量处理组（16mg和24mg）与对照组之间在培养第二、第三和第四代具有显著的差异(P＜0.05)，而且不同剂量间有显著的线性效应(P＜0.05)。各组之间丙酸和戊酸浓度没有发生规律性变化。各处理组乙酸/丙酸比例在培养第二、第三和第四代显著降低，而且不同剂量间有显著的线性效应(P＜0.05)，第四代不同剂量间有显著的二次方效应（P＜0.05）。虽然差异不显著，高剂量处理组（16mg和24mg）的丁酸浓度均高于对照组和低剂量处理组(8mg)，而异丁酸和异戊酸浓度均低于对照组和低剂量处理组。DGGE分析结果表明，24mg处理组甲烷菌DGGE图谱上的很多优势条带在第三、第四代逐渐消失，但在第五代又出现了许多优势条带，但瘤胃总细菌的DGGE图谱上无差异性条带出现。定量PCR结果显示，高剂量处理组（16mg和24mg）甲烷菌的mcrA基因数量在第二、第三代急剧降低，与对照组之间有显著差异(P＜0.05)，而且皂甙添加量之间具有显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)的线性效应，但是，从第四代开始呈现逐渐回升的趋势，第五代时各组之间的差异不再显著（P＞0.05）。各处理组总细菌数量均低于对照组，但是差异不显著(P＞0.05)，第三代在不同添加量之间有显著的线性效应(P＜0.05)。培养每一代，各处理组黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量均低于对照组，其高剂量处理组（16mg和24mg）产琥珀酸丝状杆菌数量在培养的第一代和黄化瘤胃球菌数量在培养第二、第三代与对照组之间的差异显著(P≤0.05)，尤其是，前三代黄化瘤胃球菌数量与皂甙剂量之间有显著的线性效应（P＜0.05）。以上结果表明，添加不同水平的绞股蓝皂甙后，在传代培养过程中，瘤胃微生物的发酵参数、甲烷产量及重要微生物区系和数量逐渐发生变化，以适应有皂甙存在的生长环境。