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研究背景与目的:自体脂肪移植由于其良好的生物相容性,较低的组织排斥率和过敏反应率而被广泛用于整复外科的各种治疗。然而,脂肪移植物的不稳定留存一直是临床需要克服的关键问题。脂肪组织对缺血的耐受性较差,早期血供的建立对于脂肪移植物的存活至关重要,因此,促进脂肪移植物的早期血管形成是提高脂肪移植存活率的重要策略。目前,干细胞疗法在促血管化方面具有很高的应用价值,但其促肿瘤形成的风险以及转化技术的困难大大限制了干细胞的临床应用。因此,寻找可替代干细胞的能直接应用且具有促血管效应的关键活性成分,可以最大程度地避免上述潜在问题。外泌体（exosome,Exo）是由细胞释放到细胞外基质中的一类直径约为30-150nm的膜性囊泡,可以携带多种生物组分,如蛋白质、脂质和非编码RNA等,可通过膜融合或内吞作用调节靶细胞的生物活性。大量研究将人脂肪干细胞外泌体（human adipose-derived stem cell exosome,h ADSC-Exo）应用于缺血性损伤疾病,显示出与人脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells,h ADSCs）相似且良好的促血管再生作用,并且具有免疫原性低、无肿瘤形成风险、稳定性高以及易于储存和运输的优势。本课题组前期研究发现,h ADSC-Exo和人包皮成纤维细胞外泌体（human foreskin fibroblast exosome,HFF-Exo）之间存在一些差异表达的mi RNAs（DE-mi RNAs）,这些DE-mi RNAs可能通过调节一些基因的功能,显著促进了人工真皮预构皮瓣的血管生成作用。因此,h ADSC-Exo能否通过这些DE-mi RNAs提高脂肪移植物留存能力及其潜在的再生机制引起了课题组的强烈兴趣。在这项研究中,通过将h ADSC-Exo和HFF-Exo与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）或h ADSCs在体外共培养,探讨两种Exo对HUVEC功能和h ADSCs成脂分化能力的影响。通过建立裸鼠移植模型,将两种Exo与脂肪移植物共移植,本研究探索了h ADSC-Exo对脂肪移植物存活的影响及其潜在机制。研究方法:1.将抽脂得到的脂肪组织剪碎后,置于配制好的消化提取液中,经消化、研磨、过筛、离心等步骤后,完全培养基重悬细胞并铺板培养。光镜下观察h ADSCs的形态,进行h ADSCs表面特异性标志物的流式鉴定并诱导h ADSCs的成骨和成脂分化以鉴定其多向分化潜能。2.用无Exo血清配置的完全培养基对提取的h ADSCs和人包皮成纤维细胞（human foreskin fibroblasts,HFFs）进行体外培养,分别收集第三代至第六代h ADSCs以及HFFs的细胞培养上清。随后,通过超速离心法对上清中的Exo进行分离纯化。借助透射电镜观察Exo形态特征,纳米粒子跟踪分析检测Exo的大小以及蛋白印迹技术检测Exo特异性膜蛋白（CD63和CD81）的表达情况。3.利用DAPI标记HUVEC的细胞核,将被标记的HUVEC细胞分别与被PKH67绿色荧光染料标记的h ADSC-Exo和HFF-Exo共孵育,在倒置荧光显微镜下观察HUVEC细胞对两种Exo的摄取情况。4.建立h ADSC-Exo和HFF-Exo与HUVEC及h ADSCs的共培养体系。首先利用CCK-8细胞增殖实验检测不同浓度的h ADSC-Exo对HUVEC增殖活性的影响,来确定合适的Exo作用浓度用于后续的体外和体内实验。随后,通过Ed U增殖实验与Transwell迁移实验分别评估两种Exo对HUVEC增殖和迁移能力的影响,同时利用成脂分化诱导实验评估两种Exo对h ADSCs成脂分化能力的影响。5.建立脂肪移植裸鼠模型,并分为h ADSC-Exo组和HFF-Exo组,对两组裸鼠的脂肪移植物进行不同的干预。随后,利用脂肪移植物石蜡切片进行苏木精伊红、免疫组织化学和免疫荧光染色,在组织、细胞层面上评估脂肪移植物的留存效果、新生血管化以及脂肪移植物中h ADSCs的成脂分化效果。最后,借助生物信息学以探讨促脂肪移植物存活的潜在分子机制,并通过蛋白印迹技术检测脂肪移植物VEGFA蛋白的表达情况以及Wnt/β-catenin信号通路的激活情况。结果:1.原代提取的h ADSCs分裂增殖且呈长梭状,传代培养后细胞形态均一,呈螺旋状、成簇生长。h ADSCs表面特异性标志物的流式鉴定显示:CD29、CD44和CD90阳性,表达率分别为99.10%、98.61%和99.04%。而CD34和CD45的阳性表达率分别为0.74%和0.49%。h ADSCs的多向分化诱导实验显示:提取的h ADSCs成功诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞,具有多向分化的特性。2.透射电子显微镜下观察h ADSC-Exo和HFF-Exo形态显示:两种Exo均呈圆形或椭圆形且具有磷脂双层结构的特征形态。纳米粒子跟踪分析结果显示:h ADSC-Exo的平均粒径为139.5±93.3nm,HFF-Exo为131.0±52.2nm。蛋白印迹结果显示:两种Exo均表达CD63和CD81。上述结果证明已经成功分离了Exo,可用于后续的研究。3.倒置荧光显微镜下观察荧光标记的Exo与HUVEC细胞共孵育的实验显示,有DAPI标记的HUVEC细胞的胞浆中可见PKH67绿色荧光染料标记的Exo,说明h ADSC-Exo和HFF-Exo可以被HUVEC细胞摄取。4.CCK-8增殖实验结果表明,含有100μg/ml h ADSC-Exo的培养基的促HUVEC增殖的作用最为明显。通过Ed U增殖实验和Transwell迁移实验,本研究发现相较于HFF-Exo,h ADSC-Exo可以更有效地促进HUVEC细胞的增殖和迁移活力（P＜0.01）。成脂分化诱导实验显示:相比较HFF-Exo,h ADSC-Exo能更好地维持和促进h ADSCs的成脂分化能力。5.裸鼠脂肪移植模型结果表明:经h ADSC-Exo处理的脂肪移植物在重量、体积定量、脂肪密度以及脂肪形态结构完整性等方面均优于HFF-Exo（P＜0.05）。移植物石蜡切片的免疫组化和免疫荧光染色结果表明,相较于HFF-Exo,经h ADSC-Exo共移植的脂肪移植物,其过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferatorsactivated receptorγ,PPARγ）荧光表达强度和比例、CD31阳性血管数以及Ki67阳性增殖细胞数均显著升高（P＜0.05）。6.通过生物信息学方法,初步确定了h ADSC-Exo在h ADSCs成脂分化过程中可能靶向调控的关键基因（Target key genes,TGs）共605个。通过GO注释和KEGG途径富集分析发现,这些TGs主要与细胞外基质的生物学过程直接相关。通过蛋白质相互作用网络发现,CTNNB1是该网络中节点度最高的核心基因,同时也是Wnt信号通路的关键调节者。通过蛋白印迹实验发现,相较于HFF-Exo,h ADSC-Exo处理组的VEGFA蛋白表达上调,而Wnt/β-catenin通路表达下调（P＜0.01）。结论:本课题研究结果表明,h ADSC-Exo可促进脂肪移植物的血管生成,并通过抑制Wnt/β-catenin通路活性,维持并提高移植物中h ADSCs的成脂分化能力,共同促进脂肪移植物的留存。这一发现为h ADSC-Exo在脂肪移植中的临床转化提供了理论依据并为深入了解h ADSC-Exo在移植脂肪存活中的分子机制提供了新的思路。