肝纤维化是由数种病因导致的慢性肝病的病理学改变,是一种渐进的病理过程,是多种细胞因子、氧化应激和生长因子等一系列复杂作用的结果,其防治是当今肝病治疗的难点之一；其致病因素以酒精和乙型肝炎病毒(HBV)为主,但由一定地区差异性。肝纤维化的主要特征改变是肝脏内细胞外基质增生和异常沉积,如得不到及时救治,将引起严重的肝纤维化并转为肝硬化。肝硬化目前已成为一个危害人类生命健康的世界性问题,如果能尽早阻止其发生和转变,在一定程度肝硬化就能得到有效控制。在我国肝纤维化的发病率相对较高,是全国人民必须认真对待的一个问题。因此,目前寻找防治肝纤维化的有效药物和方法,是全国人民的迫切要求,具有深远的、重大的意义。近几年,国内外在对肝纤维化的药物实验研究方面取得了一定进展；但是在肝纤维化临床治疗领域当中,进步并不是很明显。近几年,临床虽然己有一些治疗肝纤维化的中成药和西药,但目前其疗效还不够理想,而且有些药物费用高、毒副作用较大。因此,全世界的研究者都在努力寻找价格低廉、毒副作用小、疗效确切的防治肝纤维化药物,从而能逆转和阻止肝纤维化的进程,最终达到治愈慢性肝病的目的。在临床上肝硬化和肝纤维化多数都与病毒性肝炎有关,大多数是由于慢性病毒性肝炎演变而来的,对于慢性肝纤维化的病理特征,参照以往文献报道,本课题采用猪血清诱导的免疫性肝纤维化动物模型和体外培养表型活化的肝星状细胞建立细胞模型,从病理学、多项生化指标、并采用荧光定量PCR方法、从细胞凋亡等多方面对熊果酸作用机理进行研究,以期为熊果酸在抗肝纤维化的领域得到更深入的推广、应用开发提供可靠的实验依据。1本实验采用猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型,检测熊果酸对大鼠肝组织病理变化、血清及肝组织HA、LN、C-IV、PIIINP及HyP的作用。实验结果显示：熊果酸三个剂量组损伤的肝组织明显得到改善,纤维结缔组织明显减少；可见熊果酸对大鼠肝纤维化病理变化改善明显。熊果酸大剂量组和中剂量组可显著降低血清ALT、AST、ALP水平,A/G比值得到了提高,可明显地降低大鼠血清LN、PIIINP、HA、C-IV水平,由此可见熊果酸对大鼠肝纤维化改善较为明显。2本实验采用猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型,按照试剂盒说明书制备肝脏组织匀浆,分别检测SOD、MDA、Hyp的含量。实验结果显示：模型组升高MDA含量,低SOD含量,熊果酸40mg/kg和20mg/kg组均能够降低MDA含量,SOD含量升高；模型组的大鼠肝组织Hyp含量升高明显,熊果酸大剂量组和中剂量组能够使Hyp含量显著降低；实验研究结果显示熊果酸有较好的抗免疫肝纤维化的作用。3本实验在大鼠肝组织中通过提取RNA检测了TIMP-1、TGF-β1的表达情况,结果显示熊果酸治疗的大鼠,其肝脏组织中TGF-β1、TIMP-1的表达较各自模型对照组下降较为显著,同模型组比较,熊果酸三个剂量组均可下调TIMP-1、TGF-β1表达。熊果酸各剂量组作用于肝纤维化大鼠4周后均能降低α-SMA的表达,且随熊果酸剂量增加,降低α-SMA的作用逐步增强,其最佳剂量是40mg/kg/d.4本实验通过观察熊果酸对大鼠Fas/FasL的表达与的干预作用。实验结果表明：熊果酸对肝组织及体外培养HSC Fas/FasL基因mRNA的表达可明显上调,其上调作用均好于秋水仙碱组。由此推断熊果酸是从调节Fas/FasL系统来诱导活化的HSC凋亡,从而使肝纤维化得到一定的逆转。5熊果酸对HSC增殖及分泌ECM的影响：将冷冻的HSC-T6细胞株复苏,恒温箱培养至细胞呈单层致密状,胰蛋白酶消化后传代,待细胞生长稳定后,MTT法绘制HSC-T6的自然生长曲线。细胞培养同前,加入大、中、小各个剂量熊果酸,MTT法检测细胞生长情况。用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测I、III型胶原mRNA,酶联免疫法和放射免疫法(RIA)分别检测I型胶原和透明质酸含量。结果显示：10-6mmol/L～1mmol/L不同浓度熊果酸作用的0D值比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。对照组与各熊果酸组比较,差异也无显著性意义(P>0.05)。在药物作用第5天时,各熊果酸组的细胞生长曲线均未受到抑制,反而出现刺激促进生长增殖的效果,其0D值与对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。但在其他时间段(第1天、3天、7天),熊果酸各用药组的细胞生长曲线与对照组相近,其0D值与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。提示熊果酸对HSC-T6的增殖可能未有抑制作用,也没有明显的细胞毒性作用。熊果酸对ECM合成的影响：各熊果酸组对I型、III型胶原mRNA均有明显的抑制作用,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。均以熊果酸高剂量组最为明显,熊果酸中剂量组次之,熊果酸低剂量组再次之。提示熊果酸对HSC-T6细胞I型、III型胶原mRNA表达有明显的抑制作用,这种抑制作用与剂量成正比。作用72h时,熊果酸各剂量组I型胶原分泌与对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05),但熊果酸各组组间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。提示熊果酸作用72h后对I型胶原分泌有明显抑制作用,这一作用呈现出一定的剂量依赖。对照组透明质酸分泌曲线与熊果酸低剂量组稍有重叠,位置较熊果酸高、中剂量组分泌曲线高,提示熊果酸高、中剂量组均有抑制透明质酸分泌的趋势(P>0.05),但效果并不显著。本课题采用猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型,从多方面对熊果酸治疗实验性肝纤维化的作用进行了一系列的评价,证明熊果酸对猪血清诱导肝纤维化具有显著的预防和治疗作用；并从抑制TIMP-1表达增高,从而来促进胶原降解；抑制肝星状细胞活化并促进活化的肝星状细胞凋亡相关。熊果酸对肝星状细胞活化后的ECM分泌功能有明显的抑制作用,此可能是熊果酸抗肝纤维化的主要机制之一。本实验从多方面探讨了熊果酸对HSC凋亡和凋亡的途径,结果证明熊果酸可通过Fas/FasL系统介导的肝星状细胞凋亡发挥从而最终得到治疗肝纤维化的作用。