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哺乳动物毛色调控是一个由多基因调控的复杂的过程,主要由黑色素的合成和分布决定,而黑色素是由黑色素细胞中的黑素体合成的。Tyrp2是黑色素生成的关键酶酪氨酸酶蛋白家族的第3个成员,具有多巴色素异构酶(DT)的活性,催化多巴色素转变为5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA),加速黑色素生成的作用。相对于基因的调控研究,关于miRNAs对黑色素生成调控的研究较少。miRNAs通过转录后调控抑制靶基因的翻译,参与细胞发生、增殖、分化、凋亡和肿瘤转移等多个生物学过程,甚至黑色素生成。研究miRNAs的功能,关键是确定miRNAs的靶基因。目前,miRNAs靶基因的确定方法主要通过生物信息学软件预测和实验验证。为了确定miR-27a-3p对小鼠黑色素生成的影响及其作用机制、miR-27a-3p对绵羊黑色素生成的影响以及为后续转基因动物实验寻找黑色素细胞特异性启动子,本实验通过不同的生物信息学软件对小鼠miR-27a-3p靶基因进行预测,构建靶基因3’UTR双荧光报告载体和miR-27a-3p过表达载体；共转染HEK 293 T细胞验证miRNAs和靶基因的互作关系；并对不同毛色小鼠皮肤中miR-27a-3p及其靶基因Wnt3a的表达量进行检测。通过向小鼠黑色素细胞中转染miR-27a-3p mimic, inhibitor及其相应的NC,并检测转染后细胞中miR-27a-3p和Wnt3a mRNA表达量、Wnt3a蛋白表达量以及黑色素含量,从而进一步确定miR-27a-3p在黑色素生成中的功能。根据NCBI上的绵羊的Tyrp2基因序列,寻找其启动子区域,构建真核表达载体,测序并分析启动子调控元件和转录因子结合位点。将不同片段长度的Tyrp2基因5’调控区的真核表达载体转染绵羊黑色素细胞,寻找表达启动子活性最好的Tyrp2基因5’调控区,并将绵羊pri-miR-27a连接到该真核表达载体的Tyrp2基因5’调控区下游,将该pri-miR-27a真核表达载体及阴性对照转染绵羊黑色素细胞,并检测实验组和对照组绵羊黑色素细胞中的miR-27a-3p的表达量。结果如下：1、三个miRNAs数据库均预测Wnt3a为miR-27a-3p的靶基因,Wnt3a3’UTR双荧光报告载体和miR-27a-3p真核表达载体共转染HEK 293 T细胞组的荧光活性降低41%。2、miR-27a-3p mimic、inhibitor及其NC转染小鼠黑色素细胞后,转染mimic的黑色素细胞中miR-27a-3p的表达量极显著高于其他组,而Wnt3a mRNA的表达量在各组之间差异不显著,最后,miR-27a-3p显著抑制Wnt3a蛋白的表达。3、绵羊Tyrp2基因5’调控区片段为834 bp的区域启动子活性最好。4、转染pri-miR-27a的绵羊黑色素细胞中,miR-27a-3p的表达量显著高于对照组。5、转染pri-miR-27a的绵羊黑色素细胞中,黑色素含量显著低于对照组。本研究证明Wnt3a为miR-27a-3p的靶基因,并且miR-27a-3p通过转录后调控Wnt3a的表达,从而抑制黑色素生成；miR-27a抑制绵羊黑色素生成。