【摘 要】
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PH1704蛋白酶是一种细胞内蛋白酶,来自于嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3,是C56肽酶家族的成员,具有嗜热蛋白酶的性质,酶反应速率快,在高温下不易失活,不易污染等特点,可以广泛地
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PH1704蛋白酶是一种细胞内蛋白酶,来自于嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3,是C56肽酶家族的成员,具有嗜热蛋白酶的性质,酶反应速率快,在高温下不易失活,不易污染等特点,可以广泛地应用于很多领域。本实验通过基因重组技术把嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3的PH1704蛋白质基因转移到大肠杆菌中进行表达,获得所需要的蛋白酶。PH1704蛋白酶一般是6聚体寡聚蛋白。通过定点突变实验,获得了R113T突变体,发现酶的负协同性消失,表现为正协同性,Hill常数是1.32。对于底物L-R-AMC,R113T突变体酶的kcat/Km值是WT的PH1704蛋白酶的4.4倍。表明蛋白酶PH1704可能有离子结合的别构调控,别构抑制剂为Cl-。PH1704蛋白酶中有一个硫酸根结合位点,在单体中相对应的残基分别是Arg113和Asn129。我们推测Cl-和SO2-4有相同的结合方式:Cl-与Arg113形成一个盐桥,Cl-通过水分子与Asn129形成一个氢键。通过量子力学计算,发现Cl-与Arg113和Asn129连结,Asn129也参与别构调控。为了对PH1704蛋白酶的别构调控机制有进一步的研究,通过分子对接和分子动力学模拟,解释了Cl-如何稳定蛋白酶的交界面和控制酶的活性。当有Cl-存在时,复合物的二级结构无变化,但是当Cl-不存在时,S10、S11的片层结构消失,变成了环状结构,这说明Cl-对于维持交界面的刚性结构有重要的作用。对突变体Rll3T进行动力学模拟发现,Cl-缺失,S10、S11片层结构消失,变成了环状结构,加速了AC亚基交界面氢键的形成,有利于亲核进攻。这是第一次发现Cl-离子参与别构调控,Cl-是PH1704的别构调控抑制剂,本实验丰富和发展了别构酶的理论研究,也有助于对C56肽酶家族其他成员的结构、功能、机制的研究提供借鉴作用。
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