西北民族大学硕士学位论文本文选取国家级禽畜遗传保护品种——合作猪,利用动物细胞培养技术,通过差速贴壁和差速消化法,构建了15个合作猪肾原代成纤维细胞系,并冻存细胞200余支。根据ATCC细胞建系要求,对其培养条件和生物学特性进行了分析。结果：倒置相差显微镜下细胞呈梭形或柳树叶形,生长旺盛,经48～72h培养,细胞长满单层,生长走势呈放射状或旋涡状。透射电镜显示胞浆内有纤维状结构存在。免疫组化显示波形蛋白阳性,角蛋白阴性。经DMEM(H)、MEM、RPMI1640和HamF12四种培养基各加10%FBS选择培养的结果表明,DMEM(H)培养基加10%FBS最适合对该细胞的培养。间歇降温冻存法冻存的细胞,复苏后细胞生长状态良好,生长曲线呈“S”型,细胞经历了潜伏期、对数期与停滞期,符合细胞体外生长规律。冻存前细胞平均成活率97%,复苏后为95%,说明该法冻存细胞效果良好。细胞核型分析显示：合作猪肾成纤维细胞染色体数目为2n=38,其中18对常染色体,1对性染色体,y染色体为最小的中着丝粒染色体。分别统计雌雄个体来源细胞的100个细胞中期分裂相,结果为雌性2n=38占88%,雄性90%,表明所建细胞系为二倍体细胞占主体,遗传性能稳定。SDS凝胶电泳显示细胞的乳酸脱氢酶酶谱为五条区带,不同个体来源细胞经多次重复结果相同,表明所建细胞系没有发生交叉污染。脂质体介导绿色、红色荧光蛋白报告质粒转染,分别获得45%、35%的细胞转染率,表明合作猪肾成纤维细胞能有效地转染表达外源基因。细菌、真菌、支原体和病毒外源因子感染的检测结果均为阴性。结论：所构建并冻存的合作猪肾成纤维细胞系符合ATCC建系要求,为合作猪的基因组文库构建、体细胞克隆及基因遗传多样性研究等储备了理想的生物学材料,为基因工程疫苗的构建储备了细胞载体,同时也可为组织工程肾提供种子细胞。