论文部分内容阅读
第一部分：人脐带间充质干细胞的分离、培养和生物学特性鉴定目的：从新生儿脐带中分离出人脐带间充质干细胞，并鉴定其细胞表面标志物，检测其多向分化能力。方法：新鲜人脐带洗净后剥离动静脉及脐带外膜，得到脐带Wharton’s胶。采用组织块贴壁法分离、纯化得到hUC-MSCs。光镜下观察hUC-MSCs的形态及贴壁情况，采用WST-1法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞表面标志物。行成脂、成骨诱导分化实验，倒置显微镜下观察并拍照。结果：倒置显微镜下观察显示hUC-MSCs为贴壁生长，细胞随传代次数增加，逐渐纯化，呈长梭形，漩涡样生长。细胞生长曲线形状近似“S”形。表面标志物鉴定显示： hUC-MSCs强表达MSCs标志物CD90、CD29、CD73、CD105，弱表达CD106，不表达CD45、CD34及HLA-DR。诱导分化能力鉴定：hUC-MSCs可在条件培养基刺激下诱导分化为成骨和成脂细胞。结论：通过组织块贴壁法可以分离出高纯度的hUC-MSCs，经传代培养后，其表面标志物及诱导分化能力符合间充质干细胞生物学特征，可为后续实验提供稳定的细胞来源。第二部分：hUC-MSCs对肝癌细胞生长影响的体外实验研究目的：建立Transwell共培养体系，探讨hUC-MSCs在体外对Hep3B肝癌细胞增殖及迁移能力的影响。方法：取对数生长期Hep3B细胞及hUC-MSCs。细胞增殖实验：建立0.4μm的Transwell非接触式共培养体系，上层铺hUC-MSCs，下层铺Hep3B细胞。分3组：低剂量hUC-MSCs组（1hUC-MSCs：1Hep3B），高剂量hUC-MSCs组（2hUC-MSCs：1Hep3B），空白对照组。分别于24h，48h，72h采用WST-1法测定Hep3B细胞增殖情况。细胞迁移实验：分3组：低剂量hUC-MSCs组（1hUC-MSCs：1Hep3B），高剂量hUC-MSCs组（2hUC-MSCs：1Hep3B），空白对照组。共培养24小时后结晶紫染色迁移至下层的Hep3B细胞，并随机取5个高倍镜视野计数迁移的Hep3B细胞数目。结果：增殖实验：Hep3B与hUC-MSCs共培养24h后，各组细胞增殖情况相同（P>0.05）；共培养48小时、72小时后，与对照组比较，两实验组的细胞增殖减弱（P<0.05）。迁移实验：肿瘤细胞迁移数目分别为低剂量组：92.50±11.36个，高剂量组：134.76±16.43个，对照组：67.33±8.72个。各组差异有统计学意义（P<0.05）。结论：hUC-MSCs在体外与Hep3B细胞经一定时间共培养后，可抑制Hep3B细胞的增殖。hUC-MSCs在体外可促进Hep3B细胞的迁移。第三部分：hUC-MSCs对Hep3B肝癌生长的体内实验研究目的：建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型后，研究经尾静脉输注hUC-MSCs对移植瘤生长的影响。方法：模型的建立：取对数生长期的Hep3B细胞，按2×107个/部位注射于裸鼠股部皮下，待肿瘤生长至一定体积后，随机分为实验组和对照组。实验组经尾静脉注射1×106个/ml的hUC-MSCs细胞悬液0.5ml，对照组注射等体积PBS，每周注射1次，共注射3周。每4天测量一次肿瘤体积。于3周后处死裸鼠，剥离出肿瘤组织及肺脏、肝脏组织，行HE切片检查。肿瘤组织另行Ki-67免疫组化。结果：实验组hUC-MSCs的裸鼠移植瘤体积（2257.34±279.42mm3）小于对照组移植瘤体积（3215.20±408.25m3）（p<0.05）。实验组Ki-67的表达低于对照组（p<0.05）。肺脏及肝脏组织的HE切片中均未发现转移瘤的证据。结论：经尾静脉输注hUC-MSCs在体内可以抑制裸鼠移植瘤的生长，但对其转移无显著影响。