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氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)是一类古老的多结构域蛋白质家族,催化tRNA的氨基酰化反应,生成氨基酰-tRNA(aminoacyl-tRNA),为蛋白质生物合成提供原料。根据aaRS一级序列中的特征结构花式(motifs)以及催化功能域拓扑结构,20种aaRS被分为两类,Ⅰ类酶和Ⅱ类酶各10种。研究人员发现,存在一类蛋白质分子,它们的一级序列中包含了aaRS的特征结构花式,或者在三级结构上含有aaRS的某些特征结构域。这类蛋白质分子称为类氨基酰-tRNA合成酶(类aaRS)蛋白质。与氨基酰-tRNA合成酶的经典功能相比,类氨基酰-tRNA合成酶蛋白质的功能十分多样化,包括蛋白质翻译控制,参与氨基酸合成,强化DNA合成等等。 一般认为,aaRS的祖先蛋白质分子以核心酶(core enzyme)存在,行使基本的催化功能。如今的aaRS是通过在该祖先核心酶在进化中逐渐插入其它结构域成为具有更多功能的酶而来。目前自然界所有已知的aaRS中,多数都有一些附加结构域,与tRNA识别,氨基酰化和编校相关。序列和结构类似性分析表明,类aaRS蛋白质是在进化过程的不同阶段被aaRS的核心酶招募,成为当今aaRS的新结构域。 独立存在的蛋白质分子ProX,广泛存在于多种物种中,与来源于细菌的脯氨酰-tRNA合成酶(ProRS)的顺式编校结构域(INS)同源。有研究显示,细菌来源的Clostridium sticklandii ProX(CsProX)可以在体外编校错误的产物A1a-tRNAPro,其中的一个保守的组氨酸残基决定了氨基酸底物的特异性。然而,关于人ProX(HsProX)的研究尚无报道。我们研究了HsProX基因HsproX在人的9株不同的细胞系中的转录水平,首次克隆了编码人HsProX的基因,在大肠杆菌体内实现了HsproX高表达,通过亲和层析的方法得到了高纯度的蛋白质,研究了该酶的编校功能。我们的研究结果表明独立存在的HsProX,与细菌来源的ProRS的编校结构域具有同源性,可以水解误氨基酰化的A1a-tRNAPro,但是无法水解另一个误氨基酰化产物Cys-HstRNAProUGG。HsProX可以特异性识别接载在tRNA3末端的丙氨酰基,具有氨基酸底物特异性。虽然HsProX没有tRNA的底物特异性,但是tRNA的CCA76末端对HsProX的编校活力至关重要。另外,我们也鉴定了影响HsProX编校活力的关键氨基酸残基,发现K37,L39和G93中任何一个氨基酸残基发生突变,HsProX都将完全丧失编校活力。 此外,本博士学位论文还对天蓝色链霉菌中的精氨酰-tRNA合成酶的功能进行了探索。天蓝色链霉菌的基因组序列包含了一个编码精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)的重复基因,但两个亚型之间存在显著的差别。其中一个亚型的基因编码含有590个氨基酸的ScoArgS2,十分接近经典的ArgRS;第二个亚型的基因编码只含有352个氨基酸的短形式Sco ArgS1。序列分析暗示短形式亚型ArgS1缺少催化中心、特征序列HIGH和KMSKS以及其它氨基酰化活性部位的保守序列,而只保留ArgRS通常的N-端和C-端的tRNA结合元件。本研究中,我们克隆了这两个亚型的基因,在体外纯化得到了蛋白质,研究了经典亚型ScoArgS2的基本性质和催化动力学性质,测定了短形式Sco ArgS1和经典亚型ScoArgS2与tRNAArg底物的结合常数。我们制备了抗Sco ArgS1的兔多克隆抗体,进一步探索了ScoArgS1的潜在功能。有趣的是,我们发现,培养基中含有的精氨酸与赖氨酸会影响Sco ArgS1的mRNA和蛋白质水平。 总之,我们的研究结果为进一步了解类aaRS蛋白质的功能提供了信息。大多数类aaRS蛋白质的功能尚未明确,对类aaRS蛋白质家族的深入研究,可以为我们进一步了解经典aaRS各个结构域的进化过程提供潜在的线索。