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原始生殖细胞是精子和卵子的祖细胞,具有分化成精原细胞或卵原细胞的潜能。原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)具有多能性,能分化为精原细胞或卵原细胞最终形成配子。通过对原始生殖细胞由浅入深的逐渐探索,其在动物遗传领域和生殖医学领域的价值越来越重要。研究原始生殖细胞有助于揭示生殖细胞发生发育过程中相关基因作用机制和表观遗传学修饰调控机制,为生产转基因动物提供材料,也辅助指导生殖疾病的相关研究;然而,目前对原始生殖细胞的形成机制的研究尚不完全清楚,难以在体外诱导获得大量的原始生殖细胞,阻碍了其在动物遗传学和生殖医学领域的应用。近年来,随着测序技术的发展人们对表观遗传学修饰有了更全面的认识,其中lncRNA与雄性生殖方面的研究尤为受到关注。研究表明在雄性哺乳动物的睾丸组织中存在着大量特异性表达的lncRNA,其中多条lncRNA与精子发生紧密相关,并且在雄性生殖细胞增殖、分化的过程中起到重要调控作用。由于PGC细胞是精子的祖细胞,所以推测lncRNA对PGC的形成和分化起关键调控作用。然而目前针对lncRNA与生殖过程相关的研究主要集中在哺乳动物或果蝇,斑马鱼等模式生物上,在家禽上的研究十分欠缺,因此深入挖掘lncRNA在鸡PGC形成中的功能并揭示其调控机制显得尤为重要。因此本课题前期以如皋黄鸡为对象,取鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)、PGC等进行了单细胞高通量测序,依据结果筛选出了一些在PGC中特异性高表达的lncRNA,其中一条lncRNA是在鸡ESC细胞和PGC细胞中差异表达,存在于鸡6号染色体上且预测靶向Trim8基因,因此将其命名为lncRNA-CEPT8并推测该lncRNA参与调控PGC的形成。为了研究lncRNA-CEPT8的在鸡PGC形成过程中的功能和调控机制,本研究利用RNA干扰技术,qRT-PCR技术等,分析了 lncRNA-CEPT8的理化性质,从体内和体外两个水平验证了其在鸡PGC细胞形成中的功能,并对其预测靶基因和关联信号通路进行了验证,研究了其启动子受到的转录因子和表观遗传学修饰的影响。为提高体外诱导获得PGC效率提供理论基础。研究结果如下:(1)lncRNA-CEPT8全长扩增,亚细胞定位与编码能力鉴定:基于高通量测序结果筛选出在鸡PGC中特异性高表达的lncRNA,命名为lncRNA-CEPT8,通过RACE实验获得lncRNA-CEPT8全长(共1248bp),qRT-PCR验证其在鸡PGC细胞中特异性高表达(ESC:2.562±0.285,PGC:6.447±0.837,SSC:3.852±0.261),与转录组测序结果(ESC:0.074,PGC:1.477,SSC:0.100)结果相符,亚细胞定位发现lncRNA-CEPT8在细胞质中富集(77.1%),通过ORFFinder线上软件对lncRNA-CEPT8序列进行开放阅读框预测,获得一个共计246bp的ORF,共编码81个氨基酸,构建原核融合表达载体并通过Western Blot检测lncRNA-CEPT8编码能力,发现lncRNA-CEPT8能够编码一个长度约为9KD的小肽,证明lncRNA-CEPT8具有编码能力。(2)lncRNA-CEPT8在鸡PGC形成过程中的功能探究:根据已经获得的lncRNA-CEPT8全长序列设计三个RNA干扰位点,将干扰RNA序列连接至pGMLV-SC5载体,转染至DF-1细胞中检测干扰效率,结果表明shRNA2-CEPT8干扰效率最高(65.78%±4.6%),因此使用shRNA2-CEPT8进行慢病毒包裹进行实验;克隆lncRNA-CEPT8全长,连接pcDNA3.0载体完成构建过量表达pcDNA3.0-CEPT8载体。体内实验:为了研究lncRNA-CEPT8在PGC细胞形成中的功能,分别将干扰载体和过表达载体注射进孵化至1.5天的鸡胚血管内,孵化至4.5天时收集生殖嵴分离PGC细胞qRT-PCR检测PGC细胞标记基因Cvh和C-kit后发现,干扰组(Cvh:5.94±5.87,C-kit:6.57士1.69)的表达量显著低于空白对照组(Cvh:6.14±1.43,C-kit:8.74±1.88)和过表达组(12.90±4.08,C-kit:11.43±3.86)(P<0.01);流式细胞分析结果表明干扰组(4.12%±1.45%)的阳性细胞率显著低于空白对照组(51.1%±9.73%)和过表达组(56.2%±8.65%)(P<0.01);鸡胚石蜡切片免疫组织化学染色后显微镜下观察发现过量表达组(14±1.667个,400×背景)的阳性细胞数量多于空白对照组(9±1个,400×背景)和干扰组(2个,400×背景),干扰组阳性细胞数量仍然少于对照组;体外实验:为了证明体内实验结果的准确性,分别将干扰和过表达载体转染鸡ESC细胞,在BMP4诱导下观察各组细胞形态学变化,结果表明干扰lncRNA后类PGC形成数量显著少于空白对照组和过表达组;qRT-PCR检测转染4天后PGC细胞标记基因Cvh和C-kit后发现,干扰组(Cvh:14.56±3.22,C-kit:3.67±0.85)的表达量显著低于空白对照组(Cvh:15.74±3.67,C-kit:3.82±0.50)和过表达组(Cvh:19.65±1.53,C-kit:2.996±2.35)(P<0.01);流式细胞分析结果表明干扰组(0.19%±1.21%)的阳性细胞率显著低于空白对照组(1.55%±1.89%)和过表达组(1.08%±5.50%)(P<0.01);间接免疫荧光结果表明过表达组的核表达载体pCEPT8-EGFP,转染DF-1细胞后发现克隆片段能够表达荧光,证明其具有启动子活性;分别构建启动子逐段缺失载体pl～p5,启动子活性检测结果表明p3段启动子活性最高为启动子关键正向调控区域;筛选可能存在的转录因子结合位点并进行转录因子重复载体构建,转染后检测相对荧光表达量,结果表明PAX2,PAX5正向调控lncRNA-CEPT8表达,Klf4正向调控lncRNA-CEPT8的表达;在转染了 pGL3-p3(启动子区564bp-763bp区域)的DF-1细胞培养基中添加甲基化抑制剂5’Azadc和乙酰化抑制剂TSA,结果表明启动子活性均显著下降。综上,lncRNA-CEPT8启动子关键正向调控区域在lncRNA-CEPT8上游564bp-763bp处,关键正向调控区域存在多个转录因子调控启动子活性,甲基化和乙酰化均对启动子活性具有调控作用。