论文部分内容阅读
研究背景：脉络膜新生血管（CNV）常导致视力的严重损害，乃至于视力丧失[1]。随着人类平均寿命不断增加和全球人口逐渐老龄化，继发于年龄相关性黄斑变性（AMD）的CNV逐渐成为一个严重的医学-社会问题[2]。CNV的形成包括血管生成和血管发生两种形式：血管生成是指由已经存在的微血管床产生新毛细血管的过程，而血管发生是指来自于循环中的骨髓来源细胞（BMCs）趋化并分化为血管细胞的过程[3,4]。骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）是BMCs的一个亚群，有研究表明其可特异性趋化至CNV处，并且可能作为治疗CNV的载体细胞[5]。大量遗传因素和环境因素已被确认是新生血管性AMD的危险因素。糖尿病（DM）是一种常见的慢性疾病，其发病率和患病人数呈逐年上升的趋势，已成为备受瞩目的全球性公共健康问题[6]。最近有流行病学调查表明DM可能与新生血管性AMD相关，但是尚存争议[7]。目前普遍认为在糖尿病患者中BMCs和BMSCs的数量和功能受到破坏，而糖尿病对BMCs和BMSCs参与CNV的血管发生尚无相关研究。目的：探讨高血糖对BMCs和BMSCs参与实验性小鼠CNV血管发生的影响及可能机制。方法：野生型C57BL/6J小鼠随机分为三组：正常对照组、糖尿病组（DM）和糖尿病+胰岛素治疗组（DM+INS）。DM组和DM+INS组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（60mg/kg/d）连续5d，继续观察7d后测血糖>16.7mol/l者纳入后续实验。DM+INS组小鼠在确认成功建立糖尿病模型后开始给予皮下注射胰岛素（10U/kg/d），并监测血糖。532nm倍频激光光凝建立小鼠CNV模型。激光光凝后14d，眼底荧光血管造影、脉络膜铺片和HE染色衡量CNV的严重程度；激光光凝后3d，酶联免疫吸附法（ELISA）和实时定量PCR（qRT-PCR）分别检测小鼠眼球和RPE-脉络膜-巩膜复合体中血管内皮生长因子（VEGF）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）的表达。建立以绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠为供体，野生型C57BL/6J小鼠为受体的嵌合体小鼠，流式细胞仪检测嵌合体小鼠的嵌合度。嵌合体小鼠随机分为正常对照组和DM组。激光光凝后3d脉络膜铺片和免疫荧光染色观察绿色荧光细胞即BMCs趋化至CNV的情况，免疫荧光染色观察CNV局部VEGF和SDF-1的表达；激光光凝后14d免疫荧光染色检测CNV局部BMCs表达血管内皮细胞（CD31）、血管平滑肌细胞（α-SMA）和巨噬细胞（F4/80）标志物的情况。常规方法原代培养C57BL/6J小鼠BMSCs，成脂和成骨诱导后分别以油红O和茜素红染色进行鉴定。以携带GFP报告基因的腺病毒转染第3代小鼠BMSCs，24h后观察转染效率。C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组和DM组。在激光光凝后1～2h内经尾静脉注射转染GFP的BMSCs（2×106个/只），3d后脉络膜铺片观察激光光凝处绿色荧光细胞即BMSCs趋化至CNV的情况。原代培养人BMSCs并鉴定，建立人BMSCs/视网膜色素上皮细胞（RPE）共培养体系，分别观察低糖组（D-，5.5mmol/l葡萄糖）、高糖组（D+，25mmol/l葡萄糖）和渗透压对照组（M+，5.5mmol/l葡萄糖+19.5mmol/l甘露醇）条件下，人RPE细胞对BMSCs移行的影响。ELISA检测共培养体系培养基中VEGF和SDF-1α的表达水平，qRT-PCR检测RPE细胞中VEGF和SDF-1mRNA的水平。结果：DM组较正常对照组和DM+INS组CNV严重程度明显增加，DM+INS组较DM组CNV严重程度明显减轻但仍较正常对照组加重（p<0.05）；ELISA和qRT-PCR结果提示DM组较正常对照组和DM+INS组VEGF和SDF-1表达上调（p<0.05），DM+INS组VEGF和SDF-1表达较正常对照组上调，较DM组降低（p<0.05）。嵌合度分析提示成功构建嵌合体小鼠（嵌合度＞85%）。激光光凝3d后脉络膜铺片和免疫荧光染色结果提示DM组较正常对照组BMCs面积、BMCs面积/CNV面积的比率、BMCs数量均明显增加（p<0.05），且在CNV中VEGF和SDF-1蛋白表达升高（p<0.05）。激光光凝14d后CNV中BMCs表达CD31阳性和F4/80阳性细胞的比例增加（p<0.05），而α-SMA阳性细胞的比例无明显改变（p>0.05）。培养的小鼠BMSCs呈贴壁生长，经鉴定具有成脂和成骨多向分化潜能。腺病毒转染24h后转染效率约为70%。脉络膜铺片结果表明DM组较正常对照组趋化至CNV区域的BMSCs增多（p<0.05）。体外共培养体系中高糖组较低糖组和渗透压对照组人BMSCs移行增加（p<0.05），VEGF和SDF-1蛋白和mRNA水平升高（p<0.05）。结论：高血糖可能通过上调RPE细胞中VEGF和SDF-1的表达促进BMCs趋化至CNV并参与血管发生，从而加重CNV的严重程度。