2010年,我国主要蛋鸭养殖区爆发了由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋量下降为主要临床症状,以卵巢炎、病毒性脑炎为主要病理特征的传染病,给养鸭业造成了巨大的经济损失。目前我国培养DTMUV的主要方式为鸡胚或鸭胚以及贴壁细胞培养,存在一定的局限性,为研究该病毒的大规模悬浮培养技术,本研究分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,利用鸭胚胎干细胞衍生细胞株EB66细胞进行无血清全悬浮培养技术的研究,对进一步探索鸭坦布苏病毒培养工艺和疫苗的研制提供一种新思路。2017年12月,从广东省某规模化蛋鸭养殖场采集若干份疑似为鸭坦布苏病毒病的病料,接种9日龄鸭胚3 d后开始死亡,胚体变小,肝脏、脑组织呈现肿大出血症状。收获的尿囊液无血凝性,提取RNA进行RT-PCR鉴定为阳性,常见外源病毒为阴性。该病毒可在DEF细胞上增殖,接种后48 h出现病变,ELD50和TCID50分别为10-3.67/0.2 m L和10-4.73/0.2 m L。为获得分离株的全长基因组和遗传进化情况,本研究针对该病毒设计11对引物,最终获得该分离株的全基因序列,大小为10990 bp,并命名为DTMUV QY17株。该毒株与黄病毒属司提阿万病毒同源性最高,同源性达86.9%;与2010年至2016年从鹅源、蚊源、鸡源、麻雀源分离到的19株坦布苏病毒毒株进行同源性分析,同源性为96.2%以上,由此可见鸭坦布苏病毒基因组差异性不大,病毒较稳定。为研究DTMUV QY17株的致病性,选取15只9日龄樱桃谷鸭,每只腿部肌肉攻毒剂量为0.2 m L(含1000 ELD50),3天后实验组出现死亡,死亡率为20%。解剖后,可见死亡鸭子脑组织、肝脏、脾脏等多处脏器出血肿大,病理切片显示脑组织为病毒性脑炎、胰腺颗粒性坏死、肝脏和肾脏细胞坏死、淋巴细胞浸润增生等病理变化。通过q PCR检测,显示攻毒3 d时,鸭子肝脏、脾脏、胰腺和脑组织病毒含量最高,5d后各组织器官的病毒含量开始降低。为研究分离株能否在EB66细胞稳定传代,本研究将DTMUV QY17株接种于EB66细胞,盲传至第二十代进行传代驯化,结果显示,ELD50可稳定在10-5.0/0.2 m L。培养后病毒的NS1和E蛋白基因核苷酸和氨基酸分析显示,同源性均在99.1%以上,只有1个氨基酸发生突变,证明DTMUV QY17株在EB66细胞无血清全悬浮培养中能稳定传代,且病毒滴度随着传代次数增加而提高。为研究EB66细胞无血清全悬浮培养扩增DTMUV QY17株的工艺,首先确定EB66的最佳接种浓度为1.0×106 cells/m L和最佳接种时间（TOI）为60 h,随后分别以不同MOI和不同收获时间无血清全悬浮培养DTMUV QY17株,检测ELD50后表明最佳MOI为10-5,最佳收获时间为72 h。摇瓶中优化后的条件复制于5 L生物反应器,最高的ELD50可达10-5.67/0.2 m L,高于同条件下摇瓶培养的最高ELD50(10-5.33/0.2m L),初步实现了扩大培养的工艺尝试。无血清全悬浮培养收获的病毒经过2/1000甲醛灭活24 h,乳化制备灭活疫苗并免疫14日龄樱桃谷鸭。首免14 d后进行二免,商品ELISA试剂盒检测血清结果显示抗体水平低,本研究的疫苗制备以及血清学检测方法有待进一步研究。