lncRNA5926在山羊早期胚胎发育过程中的表达和功能研究

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哺乳动物早期胚胎发育过程中有一个重要的过渡即从母源向合子的转换。在这个过程中,随着母源物质的消耗,合子基因组逐渐开始转录激活,称为合子基因组激活(zygotic genome activation,ZGA),ZGA涉及到表观遗传修饰、染色质状态改变等一系列生理过程。ZGA对于胚胎发育是一个非常重要的过程,是胚胎学领域的研究重点。随着高通量测序技术的发展,越来越多的研究发现基因组存在很多的非编码RNA,长度超过200个核苷酸的被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)。lnc RNA曾被认为是基因序列中的“垃圾”。然而,越来越多的证据表明lnc RNA对基因表达调控有重要作用,一些lnc RNA在早期胚胎中阶段特异性表达,对胚胎发育起着重要的调控作用,然而其对于胚胎发育的功能和调控机制尚未全部解析清楚。本研究首先筛选了山羊早期胚胎转录组数据中差异性表达的lnc RNA,对其预测的靶基因进行文献查阅。我们以靶基因与胚胎发育相关为标准筛选出长链非编码RNA TCONS_00135926(以下简称lnc5926);然后,通过定量PCR验证lnc5926在胚胎中的表达模式,通过敲降实验验证lnc5926在胚胎发育中的作用;构建lnc RNA5926的过表达载体,在细胞水平进行转录组测序,分析差异表达基因对胚胎发育的影响;检测敲低和过表达lnc5926后预测靶基因、细胞与胚胎测序重复差异表达基因和合子基因组激活相关基因的表达水平;最后,在细胞水平检测组蛋白赖氨酸甲基化和乙酰化水平,研究lnc5926影响胚胎发育的机制。本研究获得如下结果:(1)lnc5926在山羊早期胚胎发育过程中动态变化,符合合子基因组激活基因的表达模式;下调lnc5926水平显著降低囊胚发育率;(2)通过RACE实验获得lnc5926基因全长,成功构建过表达载体pc DNA3.1(+)-lnc5926,转染山羊胎儿成纤维(Goat fetal fibroblast,GFF)细胞,获得过表达lnc5926基因的细胞样品;细胞转录组测序共得到399个差异表达基因,其中76个上调基因,323个下调基因;与胚胎测序数据比对,在8-细胞阶段和过表达细胞中都上调的有2个基因,都下调的有1个;(3)通过敲低和过表达实验,证明lnc5926对合子基因组激活基因Zscan4和Eif1ax具有重要调控功能;(4)利用免疫荧光染色实验和Western Blot技术分析lnc5926对细胞H3K9三甲基化(H3K9 me3)和H3K9乙酰化(H3K9 Ac)水平的影响,结果表明过表达lnc5926能够降低胎儿成纤维细胞基因组H3K9 me3的水平,提高基因组H3K9 Ac的水平。综上所述,lnc RNA是山羊基因组中的重要成分,能够影响合子基因组激活相关基因的表达水平和胚胎发育率,并且可能改变组蛋白甲基化和乙酰化修饰水平,证明lnc5926对山羊早期胚胎发育有重要作用。这一研究发现为探索lnc RNA对哺乳动物胚胎发育的影响及作用机制提供新见解,为进一步探究胚胎发育的调控机制奠定基础。
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