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第一部分降钙素对卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变的作用目的:建立卵巢切除合并椎体融合大鼠模型并给予鲑鱼降钙素(salmon Calcitonin,sCT)干预,在证实该模型诱发融合部位相邻节段椎间盘退变的基础上,初步探讨降钙素对该模型的椎体融合及椎间盘退变的影响。方法:50只雌性3月龄Sprague~Dawley(SD)大鼠分别接受双侧卵巢切除术(Ovariectomy,OVX,30只)或假手术(Sham,20只),4周后两组除各自保留10只作为对照组外,其余大鼠均接受L4~5椎体融合术(Posterolateral lumbar fusion,PLF),OVX+PLF组大鼠分别接受安慰剂(OVX+PLF+V)或皮下注射s CT(OVX+PLF+s CT)治疗(16 IU/kg隔日一次,共12周)。其余三组大鼠均接受Sham+V、OVX+V、PLF+V及OVX+PLF+V组大鼠给予等体积的生理盐水作为对照。脊柱融合后12周,处死动物并取出L3~6节段及其椎间盘。先采用手法评估及X线评估融合情况,再磨钻分离双侧L4~5横突间融合部位并分离L5~6椎间盘及相邻椎体,进行脱钙、包埋、切片以及染色。对L5~6椎间盘进行van Gieson染色观察相邻节段椎间盘退变情况并进行组织学评分。同时基于VG染色图像测量对椎间盘高度、终板厚度及终板钙化面积比等进行测量和分析。结果:1融合情况评估手法检测结果:对接受PLF手术的大鼠(PLF+V、OVX+PLF+V和OVX+PLF+sCT组)检查发现棘突缠绕的钢丝完整且固定良好。所有进行PLF的大鼠均未检测到融合节段的活动。X线摄片分析结果:与PLF+V组和OVX+PLF+sCT组比较,OVX+PLF+V组融合部位密度较低,融合进程延迟。评分结果示:ovx+plf+v组显著低于plf+v组和ovx+plf+sct组。2椎间盘退变组织学观察及相关定量参数分析组织学观察及评分:sham+v组脊索细胞及髓核细胞外基质较丰富纤维环排列整齐,终板软骨层较多。ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组髓核、纤维环和终板表现出均有退变表现,包括脊索细胞数量减少并被软骨样细胞取代,尾侧髓核有粘液样改变。纤维环与髓核边界模糊,胶原丢失,排列紊乱。软骨终板有不同程度钙化。ovx+plf+v组退变较ovx+v组和plf+v组更明显。组织学退变评分结果:ovx+v组、plf+v组、ovx+plf+v组和ovx+plf+sct组均显著高于sham+v组(p<0.05),ovx+plf+v组显著高于其余各组(p<0.05)。椎间盘退变相关定量参数分析:ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组椎间盘高度明显低于sham+v组(p<0.05),而终板厚度和终板钙化面积比率明显高于sham+v组(p<0.05)。然而,经降钙素干预12周后,ovx+plf+sct组大鼠椎间盘高度显著高于ovx+plf+v组(p<0.05),而终板厚度和终板钙化面积比率显著低于ovx+plf+v组(p<0.05)。ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组椎间盘高度显著低于sham+v组,终板厚度和钙化面积比显著高于sham+v组,ovx+plf+v组椎间盘高度显著低于其余各组,终板厚度和钙化面积比显著高于其余各组。ovx+plf+sct椎间盘高度显著高于ovx+plf+v组(p<0.05),终板厚度和钙化面积比显著低于ovx+plf+v组(p<0.05)。结论:脊柱融合手术和双侧卵巢切除均可诱发大鼠椎间盘退变,接受两种造模手术较单一造模退变更加严重,该模型可用于模拟人类绝经后椎体融合术诱发的椎间盘退变,降钙素早期皮下注射能够延缓相邻节段椎间盘退变。第二部分降钙素对卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘col~i、col~iiaggrecan、mmp~13和adamts~4表达的影响目的:通过分析椎间盘col~i、col~ii、aggrecan、mmp~13和adamts~4的表达及降钙素对其表达的影响,探讨卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘基质代谢的增龄性变化及降钙素的作用。方法:50只雌性3月龄sprague~dawley(sd)大鼠分别接受双侧卵巢切除术(ovariectomy,ovx,30只)或假手术(sham,20只),4周后两组除各自保留10只作为对照组外,其余大鼠均接受l4~5椎体融合术(posterolaterallumbarfusion,plf),ovx+plf组大鼠分别接受安慰剂(ovx+plf+v)或皮下注射sct(ovx+plf+sct)治疗(16iu/kg隔日一次,共12周)。其余三组大鼠均接受sham+v、ovx+v、plf+v及ovx+plf+v组大鼠给予等体积的生理盐水作为对照。脊柱融合后12周,处死动物并取出l3~6节段及其椎间盘,分离l5~6椎间盘及相邻椎体,进行脱钙、包埋、制备石蜡切片,经免疫组织化学染色检测各组l5~6椎间盘髓核和纤维环中col~i、col~ii、aggrecan、mmp~13和adamts~4表达情况,应用imagepro~plus6.0软件对免疫组化阳性蛋白表达情况进行积分光密度(integratedopticaldensity,iod)计算,定量分析各组l5~6椎间盘中阳性细胞表达差异。结果:免疫组织化学染色结果示col~i、col~ii、aggrecan、mmp~13和adamts~4在纤维环和髓核均有阳性表达,着色浅黄或棕黄色不等,具体表达情况如下:col~i:免疫组织化学染色及iod分析结果示col~i在髓核及纤维环中表达趋势相同,sham+v组表达水平最低,ovx+plf+v组表达水平最高,两两比较结果:ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组显著高于sham+v组,ovx+plf+v组显著高于ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+sct组。col~ii:免疫组织化学染色及iod分析结果示col~ii在髓核及纤维环中表达趋势相同,sham+v组表达水平最高,ovx+plf+v组表达水平最低,两两比较结果:ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组显著低于sham+v组,ovx+plf+v组显著低于ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+sct组。aggrecan:免疫组织化学染色及iod分析结果示aggrecan在髓核及纤维环中表达趋势相同,sham+v组表达水平最高,ovx+plf+v组表达水平最低,两两比较结果:ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组显著低于sham+v组,ovx+plf+v组显著低于ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+sct组。mmp~13:免疫组织化学染色及iod分析结果示mmp~13在髓核及纤维环中表达趋势相同,sham+v组表达水平最低,ovx+plf+v组表达水平最高,两两比较结果:ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组显著高于sham+v组,ovx+plf+v组显著高于ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+sct组。adamts~4:免疫组织化学染色及iod分析结果示adamts~4在髓核及纤维环中表达趋势相同,sham+v组表达水平最低,ovx+plf+v组表达水平最高,两两比较结果:ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+v组显著高于sham+v组,ovx+plf+v组显著高于ovx+v组、plf+v组和ovx+plf+sct组。结论:卵巢切除合并椎体融合大鼠相邻节段椎间盘组织中col~iiaggrecan等基质成分丢失,椎间盘组织中col~i、mmp~13和adamts~4水平升高,降钙素干预可抑制这一进程,提示降钙素可通过调控基质代谢抑制该模型椎间盘退变。第三部分降钙素对卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎体骨密度和微观结构的影响目的:通过骨密度检测及micro~ct分析探讨降钙素对卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻椎体骨骨量和微观结构的影响。方法:50只雌性3月龄sprague~dawley(sd)大鼠分别接受双侧卵巢切除术(ovariectomy,ovx,30只)或假手术(sham,20只),4周后两组除各自保留10只作为对照组外,其余大鼠均接受l4~5椎体融合术(posterolaterallumbarfusion,plf),ovx+plf组大鼠分别接受安慰剂(ovx+plf+v)或皮下注射sct(ovx+plf+sct)治疗(16iu/kg,隔日一次,共12周)。其余三组大鼠均接受sham+v、ovx+vplf+v及ovx+plf+v组大鼠给予等体积的生理盐水作为对照脊柱融合后12周,处死动物并取出l3~l6节段及其椎间盘,经双能x线骨密度仪检测l3~l6骨密度,micro~ct分析l6椎体松质骨微观结构,感兴趣区为距离两侧生长版1mm至4mm范围松质骨,直径1.5mm的圆柱体,测算椎体骨小梁骨量及结构数据,包括:骨密度、相对体积(bone volume/trabecular volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)、结构模型指数(Struc~ture Model Index,SMI)。结果:1 L3~L6骨密度:任意两组间比较,L3~L6骨密度表现出相同的趋势,OVX+V组和OVX+PLF+V组骨密度分别显著低于Sham+V组和PLF+V组(P<0.05),OVX+PLF+sCT组骨密度显著高于OVX+PLF+V组(P<0.05)。2 Micro~CT分析结果:骨密度、BV/TV,Tb.Th和Tb.N各组间比较结果趋势相同:OVX+V组显著低于Sham+V组(P<0.05);OVX+PLF+V组显著低于PLF+V和OVX+PLF+sCT组(P<0.05)。Tb.Sp和SMI各组间比较结果趋势相同:OVX+V组显著高于Sham+V组(P<0.05);OVX+PLF+V组显著高于PLF+V和OVX+PLF+sCT组(P<0.05)。结论:早期给予降钙素干预能增加卵巢切除并椎体融合大鼠椎体骨骨量,改善椎体松质骨微观结构,其防治该模型椎间盘退变的作用可能与此有关。