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植物离体器官发生是指植物的离体组织或细胞团（愈伤组织）分化形成离体苗、根或花芽等器官的过程。拟南芥离体苗再生包括愈伤组织形成和离体苗再生两个步骤。其中,体细胞第一次有丝分裂（脱分化）是愈伤组织形成的起始步骤,亦是离体苗再生关键步骤。因此,开展愈伤组织起始的分子机理研究对于全面解析植物细胞全能性调控机制具有重要意义。本实验室前期研究发现生长素响应因子ARF10是愈伤组织起始的关键调控因子。为了挖掘更多参与愈伤组织起始的关键基因,本论文以ARF10为切入点,通过酵母双杂交,筛选出其互作蛋白HOMOLOG OF BEE2 INTERACTING WITH IBH1（HBI1）。表型分析发现HBI1促进愈伤组织起始及形成过程,证明了 HBI1 通过直接上调WUSCHEL RELATED HOMEOBOX12（WOX12）、TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1（TIR1）INDOLE-3-ACETIC ACID 7（IAA 7）/AUXINRESISTANT2（AXR2）的表达促进愈伤组织的起始及形成。进一步研究发现ARF10可直接促进WOX12表达,HBI1与ARF10通过互作协同促进WOX12表达来促进愈伤组织的起始。此外,亦发现miR393a通过剪切TIR1抑制愈伤组织形成及离体苗再生。主要研究过程和结果如下:1 HBI1调控愈伤组织起始的分子机制研究1.1 HBI1促进愈伤组织起始和形成通过酵母双杂和BIFC筛选到ARF10的互作蛋白HBI1。Co1-0、HBI1-OX（过表达系）和HBI1-SRDX（HBI1的显性抑制系）愈伤组织形成能力如下:HBI1-OX明显强于Col-0,而HBI1-SRDX明显弱于野生型,表明HBI1促进愈伤组织的形成。通过EdU实验检测了 HBI1对细胞增殖的影响,结果表明,HBI1促进了细胞周期进程中中柱鞘细胞经过G1-S期检验点到达G2期。比较CYCB1;1在HBI1-OX和HBI1-SRDX背景下的GUS活性,结果表明HBI1促进愈伤组织形成过程中细胞增殖速率。1.2 HBI1促进愈伤组织形成过程中WOX5、WOX12、TIR1和AXR2表达qRT-PCR分析发现,相比于Co1-0,WOX5、WOX12、TIR1和AXR2在HBI1-OX中上调表达,而在HBI1-SRDX中下调表达。比较了 WOX5在HBI1-OX和HBI1-SRDX背景下的GFP信号,结果表明HBI1促进了愈伤组织形成过程中WOX5的表达,推测HBI1通过上调WOX5的表达促进了外植体建成细胞向类根干细胞性愈伤组织的转变。EMSA、ChIP和LUC实验证明,HBI1通过直接结合WOX12的启动子促进其表达。WOX12相关过表达系和突变体表型分析证明WOX12促进愈伤组织的形成。EdU实验表明WOX12通过促进细胞周期进程中G1-S期的转变加速愈伤组织的起始。植物杂交互补实验表明,WOX12在遗传学上位于HBI1下游。EMSA和ChIP实验证明,HBI1直接上调TIR1的表达。表型分析证明TIR1促进愈伤组织形成。杂交互补实验表明,TIR1在遗传学上位于HBI1的下游。EMSA和ChIP实验证明,HBI1直接上调AXR2的表达。表型分析表明AXR2促进愈伤组织的形成。EMSA和LUC实验证明,ARF10通过直接结合WOX12的启动子从而促进其表达。HBI1和ARF10同时存在时比单独存在时对WOX12启动子的驱动能力强,呈现叠加效应,表明HBI1和ARF10协同调控WOX12的转录。综上,本论文通过对ARF10的互作蛋白HBI1在愈伤组织起始中的功能进行研究,揭示了 HBI1对愈伤组织起始的调控机理。2 miR393a通过剪切TIR1抑制愈伤组织形成及离体苗再生对 Col-0、p35S::miR393a-1、p35S::miR393a-2、p35S:MIM393-1和p35S:MIM393-2的愈伤组织形成和离体苗再生能力进行鉴定,结果证明miR393a抑制愈伤组织形成和离体苗再生。比较WUS和CLV3在p35S:.miR393a和p35S:M1M393背景下的GUS活性,证明miR393a抑制SAM的重建。比较了DR5在p35S::miR393a和p35S:MIM393背景下的RFP信号,结果表明miR393a抑制离体苗再生过程中生长素的响应。分析了 pTIR1::mTIR1-1和pTIR1::mTIR1-2的愈伤组织形成和离体苗再生能力,结果发现,pTIR1::mTIR1-1和pTIR1::mTIR1-2的愈伤组织形成能力明显强于Col-0。此外,pTIR1::mTIR1-2能恢复p35S::miR393a-2离体苗再生能力减弱的表型。以上结果证明miR393a通过剪切TIR1抑制愈伤组织形成和离体苗再生。综上,通过对miR393a和TIR1的功能进行研究,发现了miR393a-TIR1分子通路调控愈伤组织形成和离体苗再生。