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端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA-蛋白质复合体结构,有维持染色体稳定和基因组完整的功能,随细胞的分裂不断缩短,直至染色体丢失、融合、重组和降解,发生细胞凋亡,因而被称为细胞分裂的“生物钟”。端粒酶是一种逆转录酶,能以自身的RNA为模板合成端粒的DNA重复序列(5-TTAGGG-3)n加在染色体末端,维持端粒长度,使细胞发生永生化或变成癌细胞。端粒酶在85%以上的恶性肿瘤组织中阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。把端粒酶作为肿瘤治疗的靶点具有良好的应用前景。目前研究认为人端粒酶复合体主要由人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)和人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)组成。最近研究报道hTERT既是影响端粒酶活性的最重要部分,也是端粒酶活性的限速因子。因此,靶向hTERT显然更为理想。其中重要的方法有反义核酸技术封闭、锤头状核酶切割和抑制hTERT的转录等。RNA干扰( RNA interference,RNAi )是指由特定双链RNA (double-stranded RNA ,dsRNA)引起的转录后基因沉默现象。研究表明,Dicer核酸酶(Dicer RNase L)断裂dsRNA产生的小干涉RNA可以抑制哺乳动物体细胞和胚胎中的基因的表达。RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase ,RdRP)在扩增RNAi中起着关键性的作用,RdRP活性复制较长触发性dsRNA或以一种非引物的方式复制小干扰RNA(small interfering RNA ,siRNA ),即以siRNA为引物的RdRP反应使靶mRNA转变为dsRNA,同时复制触发性dsRNA。所有的产物又可作为Dicer的底物,起始RdRP级联反应。目的:研究载体介导RNAi技术对食管癌细胞系ECA109端粒酶及hTERT mRNA表达的抑制作用,探讨RNAi抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法:根据Gene bank中报道的hTERT的核苷酸序列,参考siRNA的设计策略,通过基因blast,挑选3条目的hTERT基因的siRNA序列:Ⅰ:T T G C A A A G C A T T G G A A T C A,Ⅱ:A G A A C G T T C C G C A G A G A A,Ⅲ:G T A C A G G T T T C A C G C A T G T,构建干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空质粒,并将其分别转染食管癌细胞系ECA109,荧光显微镜观察转染效果;24h、48h末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定细胞端粒酶活性,筛选出高效抑制端粒酶活性的hTERT siRNA,RT-PCR观察ECA109细胞中hTERT mRNA表达改变。结果:1重组质粒和空质粒酶切鉴定:经BamH I和HindⅢ酶切后干扰质粒插入片段为110bp左右,空质粒插入片段为70bp左右。2质粒转染细胞24h、48h后荧光显微镜观察各转染组均见有绿色荧光的细胞,约占细胞总数的50%-60%。3端粒酶活性测定:干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空质粒转染ECA109细胞后端粒酶活性数值:24h端粒酶活性均数依次为:0.417±0.023,0.189±0.025,0.435±0.034与对照组均数0.879±0.036比较,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有显著性差异(P<0.05)。48h端粒酶活性均数依次为:0.435±0.032,0.177±0.020,0.395±0.021与对照组均数0.847±0.027比较,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均有显著性差异(P<0.05)。各干扰质粒的抑制率:48h各干扰质粒的抑制率:干扰组Ⅰ抑制率= 49%,干扰组Ⅱ抑制率=79%,干扰组Ⅲ抑制率=53%,Ⅱ组抑制率最高。4半定量RT-PCR结果4.1 RNA电泳结果:显示18s,28s条带完整、清晰,28s带的宽度及亮度约是18s的2倍左右。4.2 hTERT和β-actin的扩增基因经电泳,结果显示扩增片段大小与所设计的大小完全一致,分别为198 bp和621bp,重组质粒Ⅱ转染的ECA109中hTERT-mRNA的表达较空质粒转染的ECA109中hTERT-mRNA表达量显著下降,hTERT扩增产物强度与内对照β-actin的比值在对照组和实验组分别为0.9323±0.0155,0.5167±0.01922,有显著性差异(P<0.01,n=4)。实验组降低为对照组的55.4%。结论:成功构建载体介导的hTERT靶向RNA干扰重组体,能有效抑制食管癌细胞系ECA109端粒酶活性及hTERT-mRNA表达,确定特异性抑制端粒酶活性的siRNA靶点,为进一步开发抗肿瘤新药和基因治疗提供试验和理论依据。