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第一部分转铁蛋白修饰载紫杉醇相变纳米粒的制备及性能测定目的1.制备一种以转铁蛋白为靶向配体、以紫杉醇为装载药物、以液态全氟戊烷为内核的相变型聚乳酸羟基乙酸纳米粒(Tf-PTX-PFP-PLGA),并对其一般性质进行测定。2.研究载PFP纳米粒体外热致相变及声致相变效能。3.研究纳米粒体外靶向鼠C6胶质瘤细胞的能力和对细胞的毒性作用。方法1.采用双乳化法和碳二亚胺法合成制备Tf-PTX-PFP-PLGA,使用普通光学显微镜和透射电镜(TEM)观察纳米粒形态;动态光散射法检测粒径分布和ZETA电位;高效液相色谱法(HPLC)检测PTX包封率、载药量及经聚焦超声辐照(Focused ultrasound,FUS)后药物释放的特性;免疫荧光法观察Tf是否被成功修饰于纳米粒表面,流式细胞计数检测连接成功率。2.以加热板加热的方式在显微镜下观察纳米粒体外热致相变特性;超声诊断仪采集辐照前及经不同声压(0.5mpa、1.0mpa、1.5mpa)、不同时长(1min、3min、5min)fus辐照后纳米粒b超及照影模式图像,利用dfy软件分析灰度值及声强值。3.流式细胞技术检测鼠c6胶质瘤细胞转铁蛋白受体(transferrinrecepter,tfr)表达情况;激光共聚焦观察tf-ptx-pfp-plga、ptx-pfp-plga及tf-ptx-pfp-plga+freetf3组各自纳米粒体外靶向c6的能力;cck8法检测各ptx制剂对细胞的毒性作用。结果1.光镜下观察见纳米粒形态规则,大小较均一,呈球形,分散性较好,透射电镜观察可见较明显的壳核结构和包裹于内部的pfp;平均粒径(352.3±14.6)nm、平均zeta电位(-24.3±0.4)mv;包封率(63.3±1.8)%,载药量(3.7±0.1)%;超声作用能促进纳米粒的药物释放;激光共聚焦观察纳米粒与抗体两者荧光重合良好,流式结果示抗体结合率99.29%±0.46%。2.当加热至48℃时,显微镜下可见纳米粒转变为微气泡;经fus辐照后,b-mode示纳米粒悬液由无回声转变为强回声,造影模式可见增强影像。定量分析示1.0mpa+3min组辐照后灰度值和声强值最大。3.流式结果示鼠c6胶质瘤细胞tfr表达阳性率为(98.87±0.57)%;激光共聚焦观察体外寻靶结果示靶向纳米粒组与c6结合量较非靶向组与竞争性抑制组明显增多。cck8结果示tf-ptx-pfp-plga对c6的细胞毒性最强。同时,非载药tf-pfp-plga对c6的增殖影响较小,安全性良好。结论成功制备tf-ptx-pfp-plga纳米粒,其具备热致相变及声致相变能力,其体外靶向鼠c6胶质瘤细胞的能力良好,并能特异性杀伤该细胞。第二部分相变型纳米粒联合聚焦超声开放血脑屏障的体内研究目的探究相变型纳米粒联合fus开放sd大鼠血脑屏障(bloodbrainbarrier,bbb)的可行性,寻找安全有效的辐照参数,测定bbb开放时间窗,同时尝试比较bbb开放形态与使用传统脂质体微泡时的差异。方法1.使用鼠脑立体定位仪及牙科钻对51只sd大鼠进行颅骨开窗。2.24只随机均分为3组,静脉注射纳米粒后联合0.5mpa、1.0mpa、1.5mpa聚焦超声(focusedultrasound,fus,1mhz)行脑组织辐照,辐照时长3min。辐照后静脉注射尹文氏蓝(evansblue,eb),通过eb在靶区渗出情况了解不同声压作用下bbb开放与否。每组选取5只,定量分析eb渗出量。每组剩余3只行he染色,了解相变型纳米粒联合不同声压的聚焦超声对脑组织的影响,筛选出安全、有效的声压值。3.24只随机均分为2组,分别接受时长为3min或5min的超声辐照,声压1.0mpa,辐照结束后分别于0h、1h、2h、4h取每组中3只行eb染色,测定eb渗出量。4.另取3只sd大鼠行fus联合传统脂质微泡(mbs)开放bbb,比较两者的eb渗出在分布形态上的差异。结果1.辐照后立即行eb染色,0.5mpa组辐照目标区域脑组织未见eb渗出,1.0mpa组与1.5mpa组可见明显的eb渗出,且1.5mpa组相较于1.0mpa组eb渗出的程度加深且范围扩大。三组eb渗出量分别为(5.9±0.7)μg/g,(9.9±2.0)μg/g和(31.8±4.9)μg/g,相较于对照组,0.5mpa组p>0.05,差异无统计学意义;1.0mpa组p<0.05,1.5mpa组p<0.001,差异有统计学意义。2.he染色:0.5mpa组和1.0mpa组镜下均未见红细胞渗出或组织损伤,1.5mpa组镜下见明显红细胞渗出带和散在的微小颅内血肿,同时见较为明显的脑组织液化、坏死。3.时间窗:0h处eb渗出既达最大值,随时间延长,eb渗出呈先快后慢的趋势逐渐降低,3min组于1h内辐照侧eb渗出降至与对侧相同水平,5min组0h点eb渗出较3min组明显增多,且时间窗延长至4h。4.eb渗出分布的对比显示,相变型纳米粒具有较好的聚焦效能。结论成功实现相变型纳米粒联合fus(1mhz)开放sd大鼠脑bbb,在满足安全有效的前提下,1.0mpa为最优声压值,为后续治疗实验打下基础。第三部分载紫杉醇相变纳米粒联合聚焦超声治疗鼠胶质瘤的体内研究目的探讨tf-ptx-pfp-plga纳米粒联合fus对于sd大鼠c6颅内原位胶质瘤的治疗效果。方法1.颅内原位胶质瘤模型建立:在鼠脑立体定位仪协助下,通过穿刺注射的方式将c6细胞接种于sd脑组织内,通过核磁扫描和he染色进行验证,通过免疫组织化学法测定肿瘤组织内tfr表达水平。2.6只荷瘤鼠随机均分为2组,分别经尾静脉注射dii标记的ptx-pfp-plga和tf-ptx-pfp-plga,激光共聚焦显微镜观察各组纳米粒在肿瘤组织内的分布情况。3.40只荷瘤鼠随机均分入生理盐水,ptx,ptx-pfp-plga、tf-ptx-pfp-plga和tf-ptx-pfp-plga+fus(1.0mpa+5min)共5组,取每组中5只,于治疗前后行核磁扫描观察各组肿瘤大小变化并记录生存时间,每组剩余3只于治疗开始后10天行HE和TUNEL染色,测定肿瘤坏死、凋亡情况。4.10只健康SD大鼠随机分为两组,分别行Tf-PFP-PLGA或生理盐水连续注射,记录体重变化,并将主要脏器行HE染色以评估载体的生物安全性。结果免疫组化示TfR在鼠C6胶质瘤组织中高表达,与流式结果相符。激光共聚焦显微镜下见Tf-PTX-PFP-PLGA较PTX-PFP-PLGA在肿瘤组织内分布明显增多。MRI示5组治疗组中Tf-PTX-PFP-PLGA+FUS组肿瘤生长明显减缓。HE及TUNEL染色结果显示Tf-PTX-PFP-PLGA+FUS组的肿瘤组织内坏死、凋亡程度最高,差异有统计学意义。中位生存期分别为22天、20天、22天、26天和33天。非载药Tf-PFP-PLGA相较于生理盐水组体重增长无明显差异,HE染色示心、肝、脾、肺、肾无明显的病理性坏死或损伤。结论所制备的Tf-PTX-PFP-PLGA相变型纳米粒具有良好的体内靶向能力,联合FUS能有效抑制SD大鼠颅内原位C6胶质瘤的增殖,促进其坏死、凋亡,延长荷瘤鼠中位生存时间。而非载药Tf-PFP-PLGA本身几乎无毒,对健康大鼠的生长没有影响。