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从毒蛇的唾液中提取的粗蛇毒,包含类凝血酶、纤溶酶、磷脂酶、抗凝蛋白、水解酶等27种酶类及神经生长因子多种生物活性物质,具有多种生物学效应,如抗凝、溶栓、抗血小板黏附聚积、去纤、降脂、扩血管、改善微循环及抗炎、止痛、抗肿瘤、抗衰老、调控机体免疫反应、促进神经细胞功能恢复等作用。苏州大学药学院对中华眼镜蛇毒开展了一系列的实验研究,其中,戴桂丽等人研究的中华眼镜蛇毒对糖尿病大鼠的影响是本课题的先导,前人的研究结果表明中华眼镜蛇毒对糖尿病大鼠具有降低血糖、抑制氧化应激、调节脂质代谢、抗炎、改善肾功能的作用,其中中华眼镜蛇毒90μg/kg/day治疗效果显著性更明显。本课题承上启下,继续探讨中华眼镜蛇毒对模拟高糖环境下肾小管上皮细胞转分化的影响,并对中华眼镜蛇毒中的主要成份-神经毒素是否在糖尿病模型大鼠发挥效应做研究。第一部分中华眼镜蛇毒对高糖环境下肾小管上皮细胞转分化的影响目的 模拟糖尿病高糖环境,体外培养人近端肾小管上皮细胞,观察高糖单因素作用下是否存在肾小管上皮细胞转分化(TEMT);并用中华眼镜蛇毒干预处理,观察其对TEMT的影响,初步探讨中华眼镜蛇毒防治糖尿病肾病的可能机制。方法 分六组培养HK-2细胞:正常F12培养基组;甘露醇组(含24.5 mmol/L D-甘露醇+F12培养基);高糖组(葡萄糖浓度30mmol/L);高糖+0.6ug/ml蛇毒组;高糖+0.8ug/ml蛇毒组;高糖+1.0ug/ml蛇毒组,于48h观察细胞形态,收集各组细胞,western-blotting法检测TGFβ1和E-cadherin蛋白水平,细胞免疫荧光测α-SMA结果 高糖组与正常组比较,E-Cadherin蛋白表达减少(P<0.05),TGFβ1,α-SMA蛋白表达增多(p<0.05);甘露醇组与正常组比较,E-Cadherin,TGFβ1,α-SMA蛋白表达无明显差异(P>0.05)。经中华眼镜蛇毒处理后的干预组与高糖组比较E-Cadherin蛋白表达上调,(P<0.05),α-SMA表达下调(P<0.05),且与中华眼镜蛇组呈剂量依赖性关系。结论 1.高糖因素可导致HK-2细胞E-Cadherin蛋白表达下调,TGFβ1和α-SMA蛋白表达增加,提示高糖能促发TEMT。2.中华眼镜蛇毒可抑制高糖环境下的HK-2细胞的转分化现象,这可能是中华眼镜蛇毒防治DN的作用机制之一。第二部分 中华眼镜蛇神经毒素对糖尿病大鼠的实验研究目的 观察中华眼镜蛇神经毒素对糖尿病大鼠血糖、生化,肾功能等指标的影响,评估中华眼镜蛇神经毒素对糖尿病大鼠治疗效果并初步探讨其作用机制。方法 链脲佐菌素腹腔(streptozotocin,STZ)注射建立DM大鼠模型,并分成5组,分别为DM模型组,眼镜蛇神经毒素药物治疗组,剂量分别为10,20,40μg/kg/day,雷公藤治疗组,另取同批次Wistar鼠作为正常对照组,各组所用鼠数量相同(n=8只)。干预14周后,将所有鼠称重,腹主动脉取血处死,留取血液样本,检测生化指标,留取肾脏及胰腺进行病理观察,对肾组织进行氧化指标检测,western-blotting法检测肾组织 TGFβ1,nephrin,podocin蛋白。结果(1)糖尿病肾损伤大鼠模型复制成功.STZ注射后,模型组血糖、尿蛋白等指标均较正常鼠发生显著性改变(P<0.05),胰腺病理显示胰岛结构严重破坏,胰岛体积大量减少、萎缩,胰岛细胞内炎性细胞浸润,肾脏病理观察显示模型组肾小球肥大增生,肾小管出现空泡变性,管腔变窄。(2)与正常组比较,DM大鼠及治疗组血肌酐均下降(P<0.05),尿素氮各组统计学上无差异(P>0.05),胆固醇在DM大鼠及治疗组均升高(P<0.05),甘油三脂各组无差异(P>0.05),乳酸脱氢酶在应用雷公藤和蛇毒后升高(P<0.05),肌酸激酶模型组下降(P<0.05),小剂量神经毒素组肌酸激酶与模型组有统计学差异(P<0.05);与模型组比较,小剂量神经毒素24h尿蛋白下降(P<0.05),雷公藤组24h尿蛋白下降(P<0.05),差异有统计学意义。(3)与正常组比较,模型组血清MDA增加,血清GSH减少,肾皮质SOD减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,神经毒素治疗组血清GSH增加,血清MDA减少,肾皮质SOD增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)与正常组比较,模型组podocin蛋白表达增多,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,小剂量,中剂量神经毒素,雷公藤组podocin蛋白表达减少,趋于正常,差异有统计学意义(P<0.05);与正常组比较,模型组nephrin蛋白表达增多,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,小剂量,中剂量神经毒素组nephrin蛋白表达减少,趋于正常,差异有统计学意义(P<0.05),小剂量尤为明显,雷公藤组与模型组无差别(P>0.05)。结论1.注射STZ(55mg/kg)试剂后,可引起注射鼠血糖浓度升高,肾功能异常,胰腺及肾脏病理改变,引发糖尿病肾脏病。2.中华眼镜蛇神经毒素能减少实验性糖尿病大鼠24小时尿蛋白,这种改变呈时间依赖性,其作用机制可能是早期参与足细胞蛋白水平的调整。