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近端脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是婴幼儿较常见的致死性常染色体隐性遗传病。致病基因为位于5q11.2-13区域的运动神经元存活基因1(survival motor neuron1，SMN1)，该基因的纯合缺失或复合杂合突变都会导致疾病的发生。约90％的SMA患儿存在SMN1基因的纯合缺失，5％～10％的患儿存在SMN1基因的复合杂合突变（即一个SMN1基因缺失，另一个SMN1基因发生了点突变）。SMN1基因内的小突变的致病机制至今尚未完全明确。本实验室报道的突变p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*分别导致在外显子2和外显子5出现了提前终止密码子(prematuretranslational-termination codon，PTC)，前期研究发现，在外周血中，携带突变的患儿的SMN1 mRNA水平显著下降。我们由此猜想，导致SMN1基因mRNA降解的突变可能是因为位于引发NMD机制(nonsense-mediatedmRNA decay，NMD)的位置，通过NMD途径介导了含有提前终止密码子的mRNA的降解，导致患儿疾病表型。NMD介导的SMN1转录本异常可能是SMA的致病机制之一，抑制NMD介导的mRNA降解，上调SMN蛋白表达可能将是一个靶向RNA的SMA治疗方向。 目的：本研究以影响SMN1 mRNA降解的突变为研究靶点，建立SMA病人淋巴细胞系和成纤维细胞系模型，通过翻译抑制实验，探讨无义突变导致SMN1基因mRNA降解的致病机制。 对象及方法： 1.研究对象 2例携带致SMN1 mRNA降解的突变的SMA患儿作为病例组。3例SMN1纯合缺失患者，5例SMN1单拷贝携带者及3例SMN1两拷贝的正常儿童作为对照组。取肝素抗凝血建立淋巴细胞系，取皮肤组织建立成纤维细胞系，准备后续研究。 2.研究方法 建立携带无义突变p.Leu228*和移码突变p.Val19Glyfs*21的患儿的永生淋巴细胞系和皮肤成纤维细胞系。检测细胞系中SMN1全长转录本和全长SMN蛋白水平，检测突变对转录水平和蛋白水平的影响。应用翻译抑制剂（嘌呤霉素和放线菌酮）分别处理病人及对照样本的淋巴细胞系和成纤维细胞系，比较处理前后fl-SMN1和SC351.7kb的mRNA转录水平。通过上述分析，确定突变是否是通过NMD机制介导SMN1转录和SMN蛋白表达下调。 结果： 1、突变p.Val19Glyfs*21在成纤维细胞系中SMN1 RNA水平为正常对照的24％(p=0.003)，淋巴细胞系中为正常对照的15％(p=0.004)。突变p.Leu228*在淋巴细胞系中SMN1 RNA水平为正常对照的5.2％(p=0.002)。两种突变的SMN1转录水平明显降低。突变p.Val19Glyfs*21的SMN蛋白表达量低于正常人，稍高于纯合缺失患者。 2、应用不同浓度嘌呤霉素（100ug/ml、200ug/ml和400ug/ml）和不同浓度放线菌酮（50ug/ml、100ug/ml和150ug/ml）分别作用5.5h、10h，病例组干预后fl-SMN1 mRNA水平均有显著提高，对照组干预前后fl-SMN1mRNA水平无统计学差异。 3、在不同突变和不同细胞系中，嘌呤霉素作用均表现时间依赖和剂量依赖，放线菌酮作用只表现时间依赖，不表现剂量依赖。不同突变对药物反应的敏感性不同。 4、携带相同突变（p.Va119Glyfs*21）的不同细胞系（成纤维细胞系、淋巴细胞系）对相同药物反应的敏感性不同。NMD作用在不同细胞系中广泛存在，效率具有差异性。 结论：SMN1基因的无义突变和移码突变产生的提前终止密码子可以通过触发NMD机制，引起SMA疾病表型。并且，在不同的细胞系中，这种mRNA的监控机制广泛存在。这使我们对SMA的致病机制研究直接靶向RNA水平，为进一步的治疗干预研究提供了新的提示。