论文部分内容阅读
前言 骨形态构建蛋白(BMPs)是属于转移生长因子家族(TGF-β)的一种多功能调节蛋白，是在对分子特殊活性的研究中发现的。最原始的BMPs是从脱矿物质牛骨中提纯出来的，然后被植入动物的非骨形成位点，因能诱导新骨及骨组织的形成而得名。目前已被确认的成员就有30多种，如BMP2、BMP4、BMP7、BMP8B等。 随着研究的进展人们发现，BMPs不仅能诱导异位骨的形成，而且能分泌多种多肽信号转导因子，对许多细胞的繁殖、凋亡、分化及器官的发育形成起着重要的调节作用。而BMP4作为BMP亚家族的重要组成成员，早在胚胎6.5天时就被检测到，而7.5天时已广泛表达于胚胎中，并且对神经系统、泌尿生殖系统、心脏的形成以及上皮细胞间的相互作用都起着重要的信号转导作用，而这种作用可能是通过与丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶Ⅱ型受体结合，使Ⅰ型受体聚集，并使其磷酸化，继而被磷酸化的Ⅰ型受体再磷酸化下游的Smads蛋白，从而激活整个传导通路而发挥作用的。目前研究已发现BMP4在许多组织、器官中都有表达，但其在成鼠肾脏中是否表达以及对缺血／再灌注肾损伤的作用究竟如何，尚无此方面的研究。 基于上述原因，本实验建立了急性肾缺血模型，通过原位杂交技术及反转录PCR技术，检测BMP4基因mRNA在正常肾脏中的表达及在缺血／再灌注损伤肾中的变化；同时通过对BMP4基因敲除鼠及BMP4、BMPR基因双重敲除鼠的肾缺血／再灌注损伤的研究，应用HE染色及对肾功能指标的测定，探讨BMP4基因敲除后对缺血／再灌注肾损伤的影响，为临床提供实验依据。本实验分三个部分，包括一、BMP4基因mRNA在鼠正常肾中的表达及其在缺血／再灌注肾中的变化；二、BMP4基因敲除鼠肾缺血／再灌注损伤的组织学改变及其作用机制；三、缺血／再灌注损伤对BMP4基因敲除鼠肾功能的影响。 实 验 材 料 1．实验动物：雄性野生型鼠190只，年龄3个月 由美国西南医学中心动物实验中心提供。 2．主要仪器：OLYMPUS荧光显微镜（美国 FISHERXi PCR扩增仪（美国FISHER太恒温水浴箱（美国FISHER厂电加热毯（美国FISHER入微动脉夹（美国ROBOZ）、匀浆仪（美国FISHER）、紫外线照射仪（美国FISH－ER）、自动紫外光相机（美国FISHER）、EC－105电泳仪（美国FISHER）＊B切片加热仪（美国 FISHER人液氮罐（美国 FISHERX Mdri个离子水过滤仪（美国扭O－RAD入5417C型离心机（美国flsgyR入RM－2045切片机（美国FISHERXFW一154多功能血液分析仪（美国FISHER） 3．主要试剂：PFA（美国 GIBCOX无水酒精（美国 GIBCOX二甲苯（美国GIBCO）、石蜡（美国GIBCO）、DEPC液（美国GIBCO）、蛋白激酶K（美国GIBCO）、乙H胺四乙酸（EDTA）（美国GIBCO）＼甲酸胺（美国GIBCO）、酵母 tRNA（美国 GIBCO厂’乍一UTP（美国 GIBCO入胎盘 RNA酶抑制剂（美国GIBCO）、S…酶及缓冲液（美国GIBCO）、QR－DNA裂解酶（美国GIBCO）。醋酸胺（美国GIBCO入SSC缓冲液（美国GIBCO厂在一流基乙醇（美国GIB－COXKodak照相乳剂（美国FISHER入苏木素（美国GIBCOX伊红（美国GIBCO）、琼脂糖电泳胶（美国FISHER），阿佛丁（INVITROGE）、TRIZOI液（美国GIBCOX随机引物（美国GIBCO入First－Strand缓冲液（美国GIB－CO）、Tis一盐酸（美国GIBCO）、SDS（美国GIBCO）、苯酚（美国GIBCO）。DNA taq聚合酶（美国GIBCO）。 实 验 方 法 1．BMP4基因mRNA在鼠正常肾中的表达及其在缺血再灌注肾中的变化：雄性野生型小鼠20只，随机分为两组，每组10只。麻醉后经中腹切口，在显微镜下找到左肾动脉，一组鼠左肾直接摘除，另一组用微动脉夹钳 ·2· 闭左肾，60分钟后开放，再灌注24小时后将肾脏切除。所有肾脏一半固定 于4％多聚甲醛中用于原位杂交切片的制作，另一半置于液氮罐中，用于 RNA的提取。应用原位杂交和反转录PCR技术，观察BMP4mRNA在正常 肾中的表达以及在缺血／再灌注肾中的变化。 2．＊＊N基因敲除鼠肾缺血／再灌注损伤的组织学改变及其作用机制： 应用PCR技术测定鼠基因型，选择三组不同类型。二组：野生型（BMP4／ BMPR：＋／＋；＋／＋）＊ 组 BMP4基因敲除鼠（BMP4／BMPR：＋／－；＋／ ＋），Ill组 BMP4、BMPR基因双重敲除鼠（BMP4／BMPR：＋／－；＋／刁，麻 醉后用微动脉夹钳闭左肾动脉，60分钟后开放，于熙注24小时户8小时。 72小时将肾脏摘除，固定于甲醛中用于石蜡切片的制作。经HE染色后观 察三组不同时间肾小管扩张、填塞、坏死面积百分数的变化。 3．缺血／再灌注损伤对BMP4基因敲除鼠肾功能的影响：应用PCR技 术测定鼠基因型，选择两组不同类型。互组：野生型（BMP4＋／十八＊ 组 BMP4基因敲除鼠oMP4＋／一人麻醉后用微动脉夹钳闭左肾动脉，60分 钟后开放，于再灌注24小时／8小时＊2小时从左