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第一章 烟草烟雾暴露对小鼠肺组织树突状细胞(CD11c+)细胞、Th17及调节性T淋巴细胞的影响目的:观察烟草烟雾暴露对小鼠肺组织树突状细胞(CD11c+)细胞、树突状细胞共刺激分子与肺组织CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+、CD4+IL-10+细胞及相关细胞因子表达的影响,探讨树突状细胞在COPD肺组织慢性炎症中的免疫性机制。方法:90只SPF级健康雄性Ba1b/c小鼠随机分为正常对照组(A组)、4周烟草烟雾暴露组(B组)、24周烟草烟雾暴露组(C组),每组各30只。C组小鼠放置于自制熏烟玻璃箱内,每天注入烟草10支,点燃后熏烟30分钟,每周5天,连续24周。A组小鼠放置于另一自制玻璃箱,在箱内自由活动30分钟,每周5天,连续24周,B组前20周处理同A组,后4周处理同C组,24周到期分批按实验方法处置。取右下肺叶组织做HE染色观察各组小鼠肺实质和小气道的病理形态变化,提取肺组织单个核细胞,使用流式细胞术检测小鼠肺组织细胞CD11c+表达的比例,使用CD11c+免疫磁珠分选纯化DCs,流式细胞术鉴定分选DCs的纯度,并检测分选细胞CD40、CD80、CD86共刺激分子的表达及肺组织细胞中CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+、CD4+IL-10+的所占比例;使用荧光定量PCR检测肺组织CD40、FOXP3+、RORytmRNA的表达,使用液相芯片技术检测烟草烟雾暴露小鼠外周血血浆及肺实质IL-10、IL-6、IL-12、IL-17A的水平。结果:小鼠暴露烟草烟雾4周后气道周围及肺泡间隔可见炎症细胞浸润,部分肺泡腔轻度扩大,暴露24周除炎症浸润还出现气道平滑肌增生,肺泡结构破坏明显;两组烟草烟雾暴露组肺组织CD11c+比例较对照组上调(P<0.05);与对照组相比,两组烟草烟雾暴露组肺组织细胞CD40、CD80、MCHⅡ类分子的表达均上调(P<0.05),4周组CD86表达上调(P<0.05)但24周组CD86的表达无明显变化(P>0.05);与正常对照组比较,4周烟草烟雾暴露小鼠的CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+细胞比例均上调(P<0.05),而 24周烟草烟雾暴露组CD4+IL-17+细胞比例较正常对照组升高(P<0.05),CD4+CD25+FOXP3+及 CD4+IL-10+较正常对照组降低(P<0.05);PCR检测CD40、FOXP3+、RORytmRNA的表达与流式结果相一致;液相芯片检测各模型组小鼠外周血及肺实质细胞因子,IL-6、IL-12,IL-17A较正常对照组比较上调,肺实质表达更明显,IL-10在4周烟草烟雾暴露组上调,24周组IL-10表达下降。结论:(1)4周短期烟草烟雾暴露促使小鼠肺组织树突状细胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86、MHC Ⅱ表达增高,提示短期烟草烟雾暴露即可促进树突状细胞活化。(2)24周长期慢性烟草烟雾暴露与4周组比较树突状细胞增多,CD40表达增强,肺组织炎症及损伤进一步加重。第二章 CD40-CD40L路径对烟草烟雾暴露小鼠髓源性树突状细胞诱导CD4+T细胞分化Th17及调节性T细胞的影响目的:观察烟草烟雾暴露对小鼠骨髓来源的树突状细胞CD40分子表达的影响以及阻断CD40-CD40L通路后髓源性树突状细胞对T淋巴细胞分化为Th17及调节性T淋巴细胞的影响。探讨吸烟及CD40-CD40L路径对髓系树突状细胞影响T淋巴细胞分化的作用。方法:采用前面的90只SPF级健康雄性Balb/c小鼠建立的正常对照组、4周烟草烟雾暴露组、24周烟草烟雾暴露组模型。体外使用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF,40ng/ml)和重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4,10ng/ml)联合诱导各模型组小鼠骨髓来源的单个核细胞分化为树突状细胞(DCs),使用CD11c+免疫磁珠分选纯化DCs后采用流式细胞术检测各组小鼠DCs细胞表面CD40分子的表达,MTT 比色法测定DCs细胞的增殖活性。再采取免疫磁珠分选的方法从Balb/c小鼠脾脏分离出CD4+T细胞。分别将各模型组小鼠培养出的骨髓来源的DCs与正常对照组小鼠脾脏细胞分选的CD4+T细胞共培养,将共培养的细胞分为正常对照组DCs+CD4+T细胞共培养组(A1组),正常对照组DCs+CD4+T细胞共培养组加入拮抗性CD40抗体组(A2组);4周烟雾暴露组DCs+CD4+T细胞共培养组(B1组),4周烟雾暴露组DCs+CD4+T细胞共培养组加入拮抗性CD40抗体组(B2组);24周烟雾暴露组DCs+CD4+T细胞共培养组(C1组),24周烟雾暴露组DCs+CD4+T细胞共培养组加入拮抗性CD40抗体组(C2组)。各组细胞在无血清培养基中培养24小时后收集细胞行流式细胞仪测定CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+、CD4+IL-10+的比例,同时用液相芯片技术检测细胞上清液IL-10、IL-6、IL-17A的水平。结果:与正常对照组比较,烟草烟雾暴露小鼠骨髓来源树突状细胞的表面共刺激分子CD40分子的表达均增高(P<0.05);MTT 比色法检测正常对照组与4周组DCs增殖活性无差异,72小时24周组DCs增殖活性较正常组降低。与正常对照组比较,烟草烟雾暴露小鼠4周共培养组 CD4+IL-17+比例升高(P<0.05),CD4+CD25+FOXP3+比例下降(P<0.05);加入拮抗性CD40抗体共培养后CD4+CD25+FOXP3+细胞比例上升,CD4+IL-17+细胞所占比例下降(P<0.01)。在24周烟草烟雾暴露小鼠细胞共培养组CD4+IL-17+细胞比例升高(P<0.05),加入拮抗性CD40抗体共培养后CD4+IL-10+细胞比例升高,而CD4+IL-17+细胞所占的比例下降(P<0.05);液相芯片检测各组细胞上清液中,细胞浓度与正常对照组相比较,加入拮抗性CD40抗体后烟草烟雾暴露组IL-10浓度升高,IL-6、IL-17A浓度降低(P<0.05)。结论:(1)4周及24周烟草烟雾暴露均促使小鼠骨髓来源的树突状细胞表面CD40分子表达上调,同时CD4+T细胞向Th17细胞分化增强;(2)阻断树突状细胞CD40信号通路可以使Th17分化受阻,提示CD40信号通路在烟草烟雾暴露小鼠CD4+T细胞向Th17细胞分化中起重要促进作用。