研究背景和目的F10基因是本课题组在已完成的国家973课题研究过程中,采用抑制性消减杂交的方法,从葡萄胎与正常早孕绒毛的差异cDNA文库中筛选出的一条功能未知新基因(GenBank登录号AB196290)。由于该基因在消减杂交过程中,是将其保存在96孔板第F10孔的位置,故以F10暂时命名该基因。前期的研究表明,F10基因在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌中均呈阳性表达且依次增强,在卵巢腺癌、子宫内膜癌等妇科肿瘤中亦呈阳性表达,但在正常子宫内膜和宫颈上皮组织中呈阴性表达。可见,F10基因可能是一种与葡萄胎的恶性变及妇科恶性肿瘤的发生有关的新基因。由于目前妇科恶性肿瘤仍是威胁广大妇女健康的主要疾病,因此,F10基因作为一种与葡萄胎的恶性变及妇科肿瘤发生相关的新基因,其功能研究对于揭示此类肿瘤的发病机制、指导临床治疗具有重要意义。但是当前关于F10基因的功能研究还处于初级探讨阶段,故尚需进一步深入研究。虽然F10基因的功能尚不完全明确,但基于F10基因在人肺癌A549细胞中呈现低表达,具有上调细胞增殖核抗原和细胞周期素D1表达而促进人肺癌A549细胞增殖的特点,其强烈提示F10基因可能通过促进肿瘤细胞增殖来发挥促进肿瘤发生、发展的作用。但目前多数学者认为,细胞凋亡功能受抑制,也会促进肿瘤的发生。那么F10基因是否也同样参与了肿瘤细胞的凋亡抑制过程?这为进一步探讨F10基因的功能提供了一个新的研究方向。细胞凋亡,是一个主动的、受多种基因调控、多种酶参与的复杂过程,涉及一系列信号传递系统的调节。借助一些凋亡相关指标的检测,不仅可以很好地反映F10基因对肿瘤细胞凋亡的影响,而且有助于进一步明确F10基因在肿瘤形成中所发挥的作用。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease, CASPASE)家族,作为凋亡机制中重要的效应子成分,参与多种与凋亡有关的生理和病理过程。其中CASPASE-3是此家族的重要一员,其表达上调,提示细胞凋亡增加；表达下调,提示细胞凋亡减少。B细胞淋巴瘤／白血病-2 (b-cell lymphoma/leukemia-2, BCL-2)家族是凋亡信号调节中最重要的基因家族,此家族成员按功能不同可分为抗凋亡和促凋亡两大类。其中BCL-2和BCL-2的相关X蛋白(bcl-2-associated X protein, BAX)是此家族中两个功能相反的成员,它们表达量的变化对细胞存亡有重要影响。目前最为常见的基因功能研究方法是基因转导技术,而适宜的基因转导载体对于基因的转导效率和持续稳定过表达起着关键作用。增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)是一种优化的突变型绿色荧光蛋白,在488nm激发波处,能形成鲜明的绿色荧光。在组织和细胞中,EGFP能耐受各种处理而保持其发光特性。pEGFP-N1作为一种真核表达载体,能够携带目的基因靶向性高效表达,且易于操作,是目前使用较为广泛和理想的载体,这为研究F10基因的功能提供了可靠的基础。本研究拟采用基因转导技术,研究以下内容：(1)以F10基因低表达的A549细胞为细胞模型,以pEGFP-N1作为真核表达载体,构建稳定过表达F10基因的A549细胞系；(2)在此基础上,探讨F10基因过表达对肺癌A549细胞凋亡的影响及机制；(3)选取紫杉醇为化疗药物,研究F10基因过表达对A549细胞化疗药物敏感性的影响；(4)将过表达F10基因的A549细胞接种裸鼠,观察F10基因对A549细胞在裸鼠体内致瘤性的影响,并通过检测与细胞凋亡密切相关的CASPASE-3、BAX和BCL-2的表达,进一步探讨F10基因影响A549细胞致瘤性的作用机制。本课题属原始创新性研究,通过研究葡萄胎高表达的F10基因对A549细胞凋亡、化疗敏感性及致瘤性的影响,期望在F10基因功能的研究中有所突破,为将来发展基于F10基因的妇科肿瘤防治新措施提供理论支持。第一章稳定过表达F10基因的A549细胞株的建立及鉴定F10基因是一种功能未知的新基因,在肺癌A549细胞中呈现低表达。pEGFP-N1载体含有EGFP,可在488nm激发波处,形成鲜明的绿色荧光,标记基因的表达情况,并且具有复制力强、含高效强大启动子和多克隆位点、含可供G418筛选的新霉素耐药标记的基因neo等特点,这些特殊结构使得它作为一种真核表达载体,能够使目的基因在靶细胞内稳定过表达。基于这种理论,我们采用基因转导技术,以pEGFP-N1为载体,将外源性F10基因导入A549细胞,期望建立一种稳定过表达F10基因的A549细胞株,为进一步研究F10基因的生物学功能提供一个实验平台。研究方法设计并构建重组质粒pEGFP-N1-F10和pEGFP-N1-Mock,经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切、DNA测序鉴定正确后,转染A549细胞株,经G418筛选,获得阳性单克隆细胞株。利用荧光定量PCR技术鉴定阳性克隆。结果1. pEGFP-N1-F10质粒鉴定结果经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后,获得与目的基因F10为888bp一致的清晰条带。经过DNA测序,所获得的F10片段与GenBank已知序列相吻合；并用Blast程序进行比对分析,与F10基因组序列完全一致。2.荧光显微镜观察稳定过表达F10基因的A549细胞重组质粒pEGFP-N1-F10和pEGFP-N1-Mock分别转染A549细胞,G418筛选4周分离出存活细胞,继续培养1周于荧光显微镜下观察,可看到两组细胞均呈现绿色荧光,转染效率均接近100%。3.荧光定量PCR检测阳性细胞克隆F10 mRNA水平F10+A549细胞中F10mRNA表达(16192.710±4061.873)高于Mock-A549细胞(1.270±0.210),其差异具有统计学意义(t=-6.904,P=0.002)。表明F10基因已稳定整合于A549细胞中,且高效表达。小结1.以pEGFP-N1为真核表达载体,设计并构建出pEGFP-N1-F10重组质粒,对pEGFP-N1-F10质粒进行酶切和测序,结果证实F10基因已成功连接至pEGFP-N1载体。2.以F10基因低表达的肺癌A549细胞为细胞模型,将pEGFP-N1-F10质粒转染A549细胞,经G418筛选,获得阳性单克隆细胞。利用荧光定量PCR鉴定阳性克隆,发现F10基因过表达组A549细胞中F10 mRNA的表达显著高于阴性对照组A549细胞,提示稳定过表达F10基因的A549细胞系成功构建,这为进一步研究F10基因的生物学功能提供了一个实验平台。第二章F10基因过表达对A549细胞株凋亡的影响细胞凋亡受到多种基因调控,涉及多种酶的参与调节,其中CASPASE-3和BAX是调控凋亡的两个重要因子。而近年来的研究表明,肿瘤的发生发展与细胞凋亡受抑密切相关。基于这些理论,我们利用已建立的稳定过表达F10基因的A549细胞株,观察F10基因过表达对肺癌A549细胞株凋亡的影响,并通过检测与细胞凋亡密切相关的BAX和CASPASE-3的表达,探讨F10基因影响A549细胞凋亡的机制。研究方法利用已建立的稳定过表达F10基因的A549细胞株,并设F10+A549细胞为实验组,Mock-A549细胞为阴性对照组,A549-WT细胞为空白对照组。采用MTT检测细胞体外增殖能力,TUNEL-FITC/Hoechst33258检测细胞凋亡情况,RT-PCR检测各组细胞BAX和CASPASE-3 mRNA表达,Western Blot检测各组细胞BAX和CASPASE-3蛋白表达,并采用析因设计方差分析和单因素方差分析比较各组之间上述指标的变化。结果1.MTT检测细胞体外增殖能力MTT法检测A549-WT、Mock-A549和F10+A549三组细胞体外增殖能力,不同细胞组之间差异具有显著性(F=48.039,P=0.000)；时间主效应差异具有显著性(F=323.264,P=0.000)；组间时间两因素交互效应差异显著(F=11.442,P=0.000)。每组细胞随时间的延长,其增殖差异具有显著性。从第12h开始,F10+A549细胞较Mock-A549细胞和A549-WT细胞生长显著增快,而Mock-A549细胞和A549-WT细胞无显著差异。2. TUNEL-FITC/Hoechst33258染色检测细胞凋亡A549-WT (5.800±1.643)、Mock-A549 (5.600±1.140)和F10+A549(1.400±1.140)三组间TUNEL-FITC/ Hoechst33258染色阳性细胞数目存在显著性差异(F=17.472,P=0.000)。其中A549-WT和Mock-A549两组细胞TUNEL-FITC/Hoechst33258染色阳性细胞数目均较F10+A549组显著增多,而A549-WT和Mock-A549细胞无显著差异。表明A549-WT和Mock-A549两组细胞中出现凋亡现象的细胞明显比F10+A549组多。3. RT-PCR检测各组细胞BAX和CASPASE-3 mRNA水平A549-WT(0.754±0.018; 6.603±0.172)、Mock-A549 (0.702±0.049; 6.920±0.188)和F10+A549(0.159±0.035；1.332±0.187)三组细胞BAX和CASPASE-3的mRNA表达均具有统计学差异(F=245.201,P=0.000；F=889.634,P=0.000)。其中F10+A549细胞中BAX和CASPASE-3的mRNA表达,均显著低于A549-WT和Mock-A549两组细胞,而A549-WT和Mock-A549细胞均无显著差异。4. Western Blot检测各组细胞BAX和CASPASE-3蛋白水平A549-WT(0.370±0.001; 0.367±0.020)、Mock-A549 (0.360±0.022; 0.385±0.009)和F10+A549 (0.172±0.032; 0.165±0.005)三组细胞BAX和CASPASE-3的蛋白表达均具有统计学差异(Welch=45.966, P=0.008; F=268.790, P=0.000)。其中F10+A549细胞中BAX和CASPASE-3的蛋白表达,均显著低于A549-WT和Mock-A549细胞,而A549-WT和Mock-A549细胞均无显著差异。小结1.利用MTT检测细胞体外增殖能力,发现从12h开始,F10基因过表达组A549细胞较阴性对照组和空白对照组生长增快,提示F10基因促进A549细胞增殖。同时,采用TUNEL-FITC/Hoechst33258染色检测细胞凋亡,发现阴性对照组和空白对照组A549细胞中出现凋亡现象的细胞均明显较F10基因过表达组多,提示F10基因过表达抑制A549细胞凋亡。2.采用RT-PCR和Western Blot检测技术,发现F10基因过表达组A549细胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组,表明F10基因下调A549细胞中CASPASE-3和BAX表达,两者参与了对凋亡的调控,提示F10基因过表达抑制A549细胞凋亡。第三章F10基因过表达对A549细胞株紫杉醇化疗敏感性的影响化疗是治疗恶性肿瘤的重要方法,传统的肿瘤治疗观念是化疗药物直接作用于核酸、微管蛋白及其它靶点以杀伤肿瘤细胞；现在认识到化疗药物也可以通过诱导细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞。近年来发现紫杉醇(TAXOL)即是通过凋亡机理发挥抗肿瘤效应,在治疗肺癌等肿瘤中被广泛应用。基于上述理论,我们以稳定过表达F10基因的A549细胞株为平台,选取紫杉醇为化疗药物,研究F10基因过表达对化疗药物敏感性的影响,并通过检测与细胞凋亡密切相关的CASPASE-3和BAX的表达,探讨F10基因影响A549细胞化疗敏感性的机制。研究方法利用已建立的稳定过表达F10基因的A549细胞株,并设F10+A549细胞为实验组,Mock-A549细胞为阴性对照组,A549-WT细胞为空白对照组,分别给予紫杉醇处理。采用MTT检测细胞体外增殖能力,TUNEL-FITC/Hoechst33258检测细胞凋亡情况,RT-PCR检测各组细胞BAX和CASPASE-3 mRNA表达,Western Blot检测各组细胞BAX和CASPASE-3蛋白表达,并采用析因设计方差分析和单因素方差分析比较各组之间上述指标的变化。结果1.MTT检测细胞体外增殖能力MTT法检测A549-WT+TAXOL、Mock-A549+TAXOL和F10+A549+TAXOL三组细胞体外增殖能力,不同细胞组之间差异具有显著性(F=75.926,P=0.000)；时间主效应差异具有显著性(F=270.007,P=0.000)；组间时间两因素交互效应差异显著(F=8.815,P=0.000)。每组细胞随时间的延长,其增殖差异具有显著性。从第12h开始,A549-WT+TAXOL和Mock-A549+TAXOL两组中A549细胞均较F10+A549组生长显著减慢,而A549-WT+TAXOL组和Mock-A549+TAXOL组无显著差异。2. TUNEL-FITC/Hoechst33258染色检测细胞凋亡A549-WT+TAXOL (40.200±3.114).Mock-A549+TAXOL(38.200±2.775)和F10+A549+ TAXOL(9.800±2.049)三组间TUNEL-FITC/Hoechst33258染色阳性细胞数目存在显著性差异(F=200.778,P=0.000)。其中A549-WT+TAXOL和Mock-A549+TAXOL两组细胞TUNEL-FITC/Hoechst33258染色阳性细胞数目均较F10+A549+TAXOL组显著增多,而A549-WT+TAXOL组和Mock-A549+TAXOL组无显著差异。表明经紫杉醇处理后,A549-WT和Mock-A549两组细胞中出现凋亡现象的细胞明显比F10+A549组多。3. RT-PCR检测各组细胞BAX和CASPASE-3 mRNA水平A549-WT+TAXOL(0.695±0.162;6.779±0.736).Mock-A549+TAXOL(0.873±0.093;7.751±0.436)和F10+A549+TAXOL(0.253±0.008;0.528±0.009)三组细胞BAX和CASPASE-3的mRNA表达均具有统计学差异(Welch=61.749, P=0.006:F=188.849, P=0.000).其中F10+A549+TAXOL细胞中BAX和CASPASE-3的mRNA表达,均显著低于A549+TAXOL和Mock-A549+ TAXOL两组细胞,而A549-WT+TAXOL组和Mock-A549+TAXOL组均无显著差异。4. Western Blot检测各组细胞BAX和CASPASE-3蛋白水平A549-WT+TAXOL(0.976±0.005；0.553±0.108)、Mock-A549+TAXOL(0.989±0.007; 0.629±0.063)和F10+A549+TAXOL(0.743±0.020;0.067±0.024)三组细胞BAX和CASPASE-3的蛋白表达均具有统计学差异(Welch=166.892, P=0.000;F=51.231,P=0.000).其中F10+A549+TAXOL细胞中BAX和CASPASE-3的蛋白表达,均显著低于A549-WT+TAXOL和Mock-A549+ TAXOL两组细胞,而A549-WT+TAXOL组和Mock-A549+TAXOL组均无显著差异。小结1.利用MTT和TUNEL-FITC/Hoechst33258染色检测技术,发现经紫杉醇处理后,阴性对照组和空白对照组A549细胞均较F10基因过表达组生长持续减慢,凋亡细胞增多,提示F10基因过表达抑制A549细胞对紫杉醇化疗的敏感性。2.采用RT-PCR和Western Blot检测技术,发现经紫杉醇处理后,F10基因过表达组A549细胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组,表明F10基因下调紫杉醇处理后的A549细胞中CASPASE-3和BAX表达,提示F10基因可下调A549细胞中CASPASE-3和BAX表达,进而抑制其对紫杉醇的化疗敏感性。第四章F10基因过表达对A549细胞株致瘤性的影响自课题组发现F10基因以来,我们前期的工作主要集中于细胞水平上的研究,而裸鼠成瘤实验则可以模拟人体内环境,在动物活体上观察F10基因对肿瘤细胞致瘤性的影响。因此,我们将前期建立的稳定过表达F10基因的肺癌A549细胞株接种裸鼠,观察F10基因对A549细胞在裸鼠体内致瘤性的影响,并探讨其机制。研究方法利用已构建的过表达F10基因的A549细胞株,制备裸鼠肺癌动物模型,致瘤小鼠随机分为A549-WT、Mock-A549和F10+A549三组。通过裸鼠成瘤实验来确定F10基因对肺癌A549细胞在裸鼠体内致瘤性的影响,应用免疫组化检测成瘤组织中CASPASE-3、BAX和BCL-2的蛋白表达,并采用单因素方差分析和重复测量方差分析比较各组之间上述指标的变化。结果1.裸鼠接种肿瘤细胞成瘤时间和成瘤率三组细胞成瘤率均为100%。接种A549-WT、Mock-A549和F10+A549三种细胞裸鼠成瘤时间存在显著性差异(F=13.523,P=0.000)。其中A549-WT和Mock-A549两种细胞接种裸鼠成瘤时间均较F10+A549细胞显著延长,而A549-WT和Mock-A549两组无显著性差异。2.裸鼠皮下成瘤组织大体观察大体观察可见F10+A549细胞成瘤体积较A549-WT和Mock-A549细胞成瘤体积明显增大。3.裸鼠皮下肿瘤在体生长速度分析组间主效应差异显著(F=23.140, P=0.000),F10+A549细胞较A549-WT和Mock-A549细胞成瘤体积在不同时间测量差异显著(F=350.516, P=0.000)；时间组间的交互效应差异显著(F=216.835,P=0.000)。其中F10+A549细胞组较A549-WT和Mock-A549细胞组肿瘤的在体生长速度显著增快,而A549-WT和Mock-A549两组间无显著差异。4.裸鼠皮下肿瘤组织HE染色切片观察A549-WT和Mock-A549两组细胞成瘤组织中出现了较多的坏死细胞,HE染色表现为均质红染、无定形物质结构,F10+A549细胞则未出现此现象。5.裸鼠皮下肿瘤组织BCL-2、BAX和CASPASE-3免疫组化分析A549-WT和Mock-A549两组细胞成瘤组织中BCL-2几乎无表达,F10+A549细胞成瘤组织中BCL-2表达较多,阳性细胞呈弥漫性分布。A549-WT和Mock-A549两组细胞成瘤组织中BAX和CASPASE-3两者表达均较强,尤以A549-WT为甚,而F10+A549细胞成瘤组织中BAX和CASPASE-3表达均很弱。小结将稳定过表达F10基因的肺癌A549细胞株接种裸鼠,发现F10基因过表达组A549细胞接种后的肿瘤,其成瘤时间缩短、瘤体积增加,肿瘤生长速度加快,免疫组化检测显示出相对于对照组较低的CASPASE-3和BAX表达水平以及较高的BCL-2表达水平。提示F10基因通过下调CASPASE-3和BAX的表达、上调BCL-2的表达,增强了肺癌A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性。全文小结1.以pEGFP-N1为真核表达载体,成功构建了F10基因稳定过表达的A549细胞系,这为进一步研究F10基因的生物学功能提供了一个平台。2.采用MTT、TUNEL-FITC/Hoechst33258染色、RT-PCR和Western Blot检测技术,发现F10基因促进A549细胞增殖、抑制凋亡、并下调CASPASE-3和BAX表达。提示F10基因过表达抑制A549细胞凋亡,其中CASPASE-3和BAX表达下调参与了对凋亡的调控。3.经紫杉醇处理后,F10基因过表达组A549细胞较阴性对照和空白对照组细胞凋亡减少,CASPASE-3和BAX表达下调。提示F10基因过表达可下调A549细胞CASPASE-3和BAX表达,进而抑制其对紫杉醇的化疗敏感性。4.将稳定过表达F10基因的肺癌A549细胞株接种裸鼠,发现F10基因过表达组A549细胞接种后的肿瘤,其成瘤时间缩短、瘤体积增加,肿瘤生长速度加快,免疫组化检测显示出相对于对照组较低的CASPASE-3和BAX表达水平以及较高的BCL-2表达水平。提示F10基因通过下调CASPASE-3和BAX的表达、上调BCL-2的表达,增强了肺癌A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性。