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背景急性心肌梗死(Acut myocardial infarction,AMI)是一种在动脉粥样硬化基础上,因血栓形成或斑块破裂阻塞血管而导致的心肌急性缺血缺氧性疾病,在全球范围内发病率和死亡率极高,严重危害人类健康。大量研究表明,细胞缺氧状态能够激活氧化应激反应,其产生的活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)可作为信号分子介导细胞凋亡。同时,ROS的累积能够引起包括DNA链断裂、DNA位点突变等多种形式的DNA损伤。为了维持基因组的完整性和稳定性,机体会启动一系列DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)。DDR是一个复杂的反应过程,经典的DDR通路包括ATR/Chk1和ATM/Chk2通路。ATR和ATM均属磷脂酰肌醇-3-激酶样激酶家族(PI3K)成员,可通过激活下游细胞周期检查点蛋白Chk1和Chk2等,引起一系列磷酸化级联反应,介导细胞周期阻滞与DNA修复;当修复失败时,可进一步激活多条死亡信号通路,最终导致细胞凋亡。有文献报道,心肌梗死后,血循环中游离DNA水平会明显升高,可以作为检测心肌细胞损伤的灵敏指标,对疾病的监控以及病情的评估发挥重要作用。在动脉粥样硬化病人的斑块组织内,也存在ATM水平的升高,且与疾病严重程度成正相关。在肾脏的缺血再灌注模型中,存在H2A.X,ATM,Chk2等蛋白磷酸化水平的增高,证实有DNA损伤反应的参与。那么,在梗死的心肌组织中,心肌细胞的急性缺血缺氧是否能够启动DNA损伤反应,以及其在缺氧诱导的心肌细胞损伤中发挥怎样的作用,目前尚不完全清楚。目的建立大鼠心肌梗死模型,检测DNA损伤反应是否参与心肌缺血缺氧性损伤;应用低氧工作站建立大鼠心肌细胞系H9C2以及新生大鼠原代心肌细胞(Neonatal rat ventricle myocardial cells,NRVMs)缺氧模型,检测DNA损伤反应是否参与缺氧诱导的心肌细胞损伤,并对其反应通路进行干预,探究抑制DNA损伤反应是否对心肌缺氧性损伤具有明显改善作用。方法(1)将6-8周龄雄性wistar大鼠随机分为假手术组和心肌梗死组,左冠状动脉前降支结扎方法建立大鼠心肌梗死模型,he染色、tunel法验证模型建立是否成功,免疫组化法检测dna损伤标志性蛋白p-h2a.x表达水平。(2)低氧工作站建立h9c2细胞缺氧模型,mtt,ldh,fcm以及wb法验证细胞模型建立是否成功;免疫荧光法检测h9c2细胞中p-h2a.x的表达;wb检测缺氧不同时间,dna损伤反应相关蛋白p-h2a.x,p-chk1,p-chk2的表达水平。(3)h9c2细胞加入不同浓度chk1抑制剂ucn-01,wb法检测缺氧6h后p-h2a.x表达水平变化;mtt,ldh法检测细胞损伤,fcm法检测细胞凋亡率变化。(4)h9c2细胞加入不同浓度atm抑制剂ku-55933,免疫荧光法检测缺氧6h后p-h2a.x表达水平变化;wb法检测dna损伤反应相关蛋白p-atm,p-h2a.x,p-chk2表达量变化;ldh,fcm,tunel以及caspase3/7活性法检测细胞损伤及凋亡情况。(5)h9c2细胞转染chk2sirna,wb法检测干扰效果;fcm,ldh以及caspase3/7活性法检测缺氧6h后细胞损伤情况变化。(6)percoll梯度密度离心法分离新生大鼠原代心肌细胞(nrvms),低氧工作站建立其缺氧模型,并用mtt,ldh,hoechst染色以及wb法验证模型建立是否成功;免疫荧光法检测加入药物ku-55933后p-h2a.x表达水平;ldh,tunel法检测细胞损伤情况。结果(1)大鼠心梗模型he染色结果显示,与假手术组相比,心肌梗死6h组心肌细胞轮廓模糊,肌纤维排列紊乱甚至断裂,tunel法染色细胞核被染成棕黄色,免疫组化结果显示梗死组织中p-h2a.x表达水平明显升高。(2)h9c2细胞随着缺氧时间延长,细胞mtt值逐渐降低,ldh值和凋亡率逐渐升高,低氧诱导因子hif1-α表达水平逐渐增高。wb结果显示,随着缺氧时间延长,dna损伤反应相关蛋白p-h2a.x,p-chk1,p-chk2的表达量逐渐增多;免疫荧光的方法对p-h2a.x进行检测,得到同样的结果。(3)H9C2细胞加入不同浓度Chk1抑制剂UCN-01缺氧6h,结果显示加药后p-H2A.X的表达量,LDH以及凋亡率均无明显变化。(4)H9C2细胞加入ATM抑制剂KU-55933缺氧6h,结果显示加入药物30μM组,p-ATM、p-H2A.X、p-Chk2的磷酸化水平均明显降低,且与p-H2A.X免疫荧光结果一致;FCM、TUNEL、LDH以及Caspase3/7活性结果显示,细胞凋亡率明显降低,凋亡阳染数目减少,LDH值降低,Caspase3/7活性降低。(5)Chk2 siRNA转染H9C2细胞,WB结果显示,60nM和100nM时,均能显著抑制Chk2表达,且100nM时抑制效果更为明显。FCM,LDH以及Caspase3/7活性结果显示,与缺氧6h组相比,转染Chk2 siRNA 100nM后,细胞凋亡率明显降低,LDH值降低,Caspase3/7活性减弱。(6)NRVMs随着缺氧时间延长,细胞MTT值逐渐降低,LDH值逐渐升高,Hoechst染色中变性、固缩、变亮细胞核数目增多,低氧诱导因子Hif 1-α表达水平逐渐增高。免疫荧光,TUNEL及LDH结果显示,加入药物KU-5593330μM后,p-H2A.X阳染及TUNEL阳染细胞核数目均明显减少,LDH值降低。结论1.DDR参与缺氧诱导的心肌细胞损伤。2.阻断ATM/Chk2通路能够明显减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤,而阻断ATR/Chk1通路没有明显效果。