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细胞凋亡与细胞增殖的动态平衡是多细胞生物维系其结构稳定和内环境功能平衡及生长发育所必需的,最基本的生物学过程。正常环境下,细胞凋亡受到严密的调控以防止因失调而导致机体病变。凋亡抑制蛋白FLIPs(FLICE/caspase8-inhibitoryproteins)作为凋亡通路的重要调节者,主要作用于死亡受体CD95(Apo-1/Fas)途径,与炎症、肿瘤、自身免疫性疾病的发生、发展密切联系在一起,如多样硬化症,老年痴呆症,类风湿性关节炎等多种人类疾病中都发现有FLIP的异常表达。
蛋白水平上FLIP存在两种形式:c-FLIPL和c-FLIPs。c-FLIPL分子结构由N端两个相互串联的DEDs和C端一个caspase样结构域组成,与caspase-8、-10高度同源。FLIP中DED与Fas的DD功能相似,能介导蛋白质之间的相互作用。它通过自身的DEDs与FADD和procaspase-8的DEDs相互作用,竞争性抑制procaspase-8的招募和激活,从而保护细胞逃脱由Fas、TNF-R1、TRAIL等导致的凋亡。
近年来,很多研究发现c-FLIP不但参与细胞凋亡,还参与细胞增殖,尤其是淋巴细胞的激活与增殖。c-FLIP这一新角色的确立以及它的生物学意义目前尚不清楚,有关它参与的促细胞增殖的信号通路还知之甚少,推测FLIP可能以多蛋白复合体的形式行使功能,这有待发现新的FLIP结合蛋白来验证这一假说。
以FLIP为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统分别对小鼠淋巴瘤文库、小鼠7.5天胚胎文库和人心脏文库经过大量的筛选,我们获得了12个与FLIP相互作用的候选蛋白质,如泛素化修饰蛋白、核蛋白和细胞周期相关蛋白等等。我们感兴趣的是RuvBL1等三个蛋白质,在哺乳动物细胞中进一步通过免疫共沉淀验证并确定了它们与FLIP相互作用的关系。其中,RuvBL1是生存所必需的一种重要核蛋白,它和FLIP之间的相互作用可能与FLIP的促增殖作用相关,我们重点对RuvBL1展开研究。
1.首次发现并确定RuvBL1是一种与FLIP相互作用的新蛋白,通过免疫共沉淀验证且初步确定了它们之间相互结合的结构区域。
2.利用免疫荧光染色技术,我们发现FLIP和RuvBL1在胞核中都有分布,并且表达分布上共同的重叠区域也是位于胞核,有力地说明了他们的相互作用在空间分布上是可能的,而且它们的相互作用发生在核内。进一步通过核提取物的westernblot验证确实了这一点,这也是首次发现FLIP在胞核中的定位,对于FLIP的功能研究具有突破性意义。
3.RuvBL1具有ATP酶的活性,我们采用原核表达蛋白RuvBL1和FLIP进行体外ATP酶的测活实验,结果发现FLIP在体外具有促进RuvBL1的ATP酶活性的作用。体内实验中,我们发现它们的蛋白表达不但在组织分布上具有相似的特异性,主要在淋巴组织中表达丰富,而且在淋巴细胞增殖过程中,随着FLIP表达水平的下调,RuvBL1后加工水平或活性形式也随之减弱。这与体外测活的结果相结合,说明了FLIP的表达或FLIP与RuvBL1之间的相互作用能够影响RuvBL1的活性。
4.据报道FLIP在胞质中的表达能够激活NF-κB/ERK信号途径,为了探索RuvBL1和FLIP的相互作用的生物学意义,尤其是它们在胞核中共同作用的生理意义,我们选择了胞核内的两个基本的转录因子NF-κB和AP-1来研究它们的相互作用的意义。采用Luciferase为报告基因进行转录活性的检测,结果显示,RuvBL1对于NF-κB途径没有影响,而对于AP-1激活具有明显的抑制。我们进一步利用了RNA干扰技术knock-down内源的RuvBL1的表达,结果发现AP-1活性不再受抑制,反而有所增强,这更证实了RuvBL1对AP-1激活的抑制作用。同样地,FLIP蛋白的加入也能够增强了AP-1的转录活性。为了说明这种现象与RuvBL1和FLIP间的相互作用有关,我们分别构建了FLIP的变体F-mutD,该变体缺失了FLIP与RuvBL1相互作用的结构域,以及RuvBL1的变体R-mutA同样缺失了与FLIP结合的结构域,将这些变体分别与全长的RuvBL1和FLIP共转染,结果显示AP-1的活性没有提高,说明了FLIP对于AP-1的激活是依赖于它和RuvBL1间的相互作用。接着,我们又进行了EMSA验证,得到了更为直接的证实。
综合上述,我们总结出一条新颖的FLIP参与促细胞增殖的信号通路即:FLIP进入细胞核,与靶蛋白RuvBL1发生相互作用,解除RuvBL1对AP-1通路的抑制,激活AP-1启动转录,从而参与细胞增殖。