论文部分内容阅读
目的探讨p27与miR-27b在重组日本血吸虫p40(rSjp40)抑制肝星状细胞(HSCs)活化中的作用及机制。方法1、rSjp40对p27启动子活性的影响及机制:(1)荧光报告基因检测实验:(1)将p27启动子(-1737bp to+24bp)序列克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,标记为pGL3-p27。将质粒分别转染到人肝星状细胞株LX-2细胞中,通过荧光报告基因检测rSjp40对p27启动子活性影响(实验分组:pGL3-Basic,pGL3-Basic+rSjp40,pGL3-p27,pGL3-p27+rSjp40);(2)将pGL3-p27全长截短分别标记为:pGL3-p27a,pGL3-p27b,pGL3-p27c,pGL3-p27d。将其分别转染到LX-2细胞中,检测rSjp40对各个截短片段启动子活性的影响(实验分组:pGL3-p27,pGL3-p27+rSjp40,pGL3-p27a,pGL3-p27a+rSjp40,pGL3-p27b,p GL3-p27b+rSjp40,pGL3-p27c,p GL3-p27c+rSjp40,pGL3-p27d,pGL3-p27d+rSjp40);(3)在LX-2细胞中,共转染E2F1干扰质粒(siRNA E2F1)和pGL3-p27,通过荧光报告基因检测E2F1对p27启动子的作用(实验分组:Control,siRNA NC,siRNA NC+rSjp40,siRNA E2F1,siRNA E2F1+rSjp40);(4)将p27启动子上E2F1结合位点突变,标记pGL3-p27mut。将pGL3-p27mut转染到LX-2细胞中,并用rSjp40处理,检测rSjp40对其影响(实验分组:pGL3-p27,pGL3-p27+rSjp40,pGL3-p27mut,pGL3-p27mut+rSjp40)。(2)Western blot实验:(1)rSjp40处理LX-2细胞后,应用Western Blot检测E2F1,p27的表达情况(实验分组:Control,rSjp40);(2)用rSjp40处理E2F1敲降的LX-2细胞,检测rSjp40对p27和α-SMA的表达作用(实验分组:siRNA NC,siRNA NC+rSjp40,siRNA E2F1,siRNA E2F1+rSjp40)。(3)CHIP实验:设计E2F1结合位点引物,通过CHIP法检测p27启动子上是否存在E2F1结合位点(CHIP实验分组:input组,抗IgG抗体组,抗E2F1抗体组)。2、miR-27b在rSjp40抑制HSCs活化中的作用及机制(1)荧光报告基因检测实验:将PPARγ-3’UTR序列连接到psi-CHECK2载体上,构建PPARγ-3’UTR荧光报告基因质粒,将miR-27b模拟物或抑制物(mi R-27b mimic或miR-27b inhibitor)和PPARγ-3’UTR共转染到LX-2细胞中,检测miR-27b模拟物或miR-27b抑制物对PPARγ-3’UTR的影响(实验分组:NC mimic+PPARγ-3’UTR,miR-27b mimic+PPARγ-3’UTR,NC inhibitor+PPARγ-3’UTR,miR-27b inhibitor+PPARγ-3’UTR)。(2)Western blot实验:(1)使用rSjp40处理LX-2细胞24h,48h,检测rSjp40对PPARγ的影响(实验分组:24h Control,24h rSjp40,48h Control,48h rSjp40)。(2)miR-27b模拟物及抑制物转染到LX-2细胞,检测PPARγ变化(实验分组:NC mimic,miR-27b mimic,NC inhibitor,miR-27b inhibitor)。(3)rSjp40与5’氮杂胞嘧啶核苷(5’AZA)共同处理LX-2细胞,通过Western Blot检测PPARγ的变化水平。(3)qRT-PCR检测:(1)rSjp40处理LX-2细胞后,应用qRT-PCR观察mi R-27b的表达水平。(2)rSjp40与5’AZA共同处理LX-2细胞,通过qRT-PCR观察mi R-27b的变化。(4)油红O染色:利用rSjp40处理LX-2细胞,用油红O染色,观察脂滴形成(油红O染色分组:Control,rSjp40)。结果1、rSjp40对p27启动子活性的作用及机制(1)rSjp40处理转染了p27启动子的LX-2细胞,荧光报告基因结果显示rSjp40能增强p27启动子的活性。(2)运用E2F1干扰质粒和pGL3-p27共转染LX-2细胞,发现E2F1被敲降后,p27启动子活性及蛋白水平明显受到抑制。(3)E2F1干扰后发现rSjp40对p27启动子活性及蛋白水平的诱导作用也受到了抑制。2、miR-27b在rSjp40抑制HSCs活化中的作用及机制(1)rSjp40处理LX-2细胞后PPARγ表达上升,而mi R-27b的表达水平下降,并且这种变化是由于rSjp40增加miR-27b甲基化水平所致。(2)miR-27b模拟物转染到LX-2细胞后,PPARγ表达明显受到抑制,mi R-27b抑制物则促进LX-2细胞中PPARγ表达;荧光素报告基因结果进一步说明了mi R-27b对PPARγ的抑制作用。(3)用rSjp40处理转染了miR-27b模拟物的LX-2细胞,发现miR-27b对PPARγ的抑制作用可被rSjp40部分逆转。结论1、rSjp40能增加转录因子E2F1的表达,进而增强p27启动子的活性。2、miR-27b能够靶向PPARγ,从而参与rSjp40抑制LX-2细胞活化的过程。