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核桃(Juglans regia L.)是市面上常见的坚果类作物之一,具有丰富的营养价值和药用功效。核桃榨油后产生大量的副产物核桃脱脂粕,通常以饲料低价出售,不仅造成核桃蛋白资源的浪费,也严重阻碍了核桃产业的发展。生物酶解技术作为一种绿色生物转化手段,一方面有助于提高底物的生物利用率,另一方面可以将核桃粕蛋白分解成更利于人体吸收的小分子化合物,增加功能活性,提高营养价值。本研究以冷榨核桃粕为原料,利用生物酶解法制备核桃多肽,并对多肽酶解过程的工具酶进行筛选,采用响应面法优化核桃粕蛋白酶解工艺。采用超滤、葡聚糖凝胶层析等方法分离纯化核桃粕蛋白酶解液,并测定酪氨酸单酚酶及二酚酶抑制率,筛选出酪氨酸酶抑制活性较高的多肽组分,对纯化后的核桃粕多肽进行液质分析,确定核桃粕多肽的氨基酸序列及分子量分布。利用Autodock Vina进行分子对接确定目标多肽,人工合成目标多肽并对其进行酶抑制动力学研究和体外消化稳定性研究,主要研究结果如下:以多肽得率和酪氨酸二酚酶抑制率为指标,筛选出酶解核桃蛋白的最优蛋白酶为碱性蛋白酶,响应面优化碱性蛋白酶酶解核桃粕蛋白的最佳条件为:温度61℃,底物浓度5.1%,pH 10.1,在此条件下核桃粕多肽得率为30.18±0.26%,与理论值基本相符。采用超滤法、Sephadex G-25凝胶层析等方法分离纯化核桃粕多肽,得到酪氨酸酶抑制活性较好的核桃粕多肽组分F1。经过LC-MS/MS分析鉴定,酪氨酸酶抑制肽F1组分中氨基酸个数在10个以下的多肽有606个。分子对接结果显示,核桃三肽FPY的对接能最低为-8.2 kcal/mol,表明FPY与酪氨酸酶活性中心结合的最稳定,因此高活性核桃粕酪氨酸酶抑制肽的氨基酸序列为Phe-Pro-Tyr,相对分子量为498.23 Da。FPY与酪氨酸酶的对接构象显示,FPY主要对接在受体蛋白酪氨酸酶(2Y9X)的凹槽中,二者之间的相互作用主要有三类:氢键、疏水相互作用、静电相互作用。酶动力学研究结果显示,人工合成短肽FPY对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶均有抑制作用,其IC50分别为0.47±0.01 mg/mL、1.37±0.03mg/mL。FPY对酪氨酸单酚酶的抑制作用类型为竞争性可逆抑制,米氏常数Km=3.56mmol/L,抑制常数Ki=22.04mmol/L,对酪氨酸二酚酶的抑制作用类型为竞争性可逆抑制,米氏常数Km=4.09mmol/L,抑制常数Ki=4.82 mmol/L,且在体外胃肠蛋白酶作用下能保持良好的酪氨酸酶抑制活性。