【摘 要】
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当前不孕症已经是全球性问题,其中男性因素约占一半。精子活力低下是导致男性不孕症的主要原因之一,其发病机制复杂,涉及环境因素、遗传因素、病原菌感染、内分泌因素等多种原因,但具体分子病理机制不明。人成熟精子是转录沉默的细胞,其基因表达调控对精子的功能作用微弱,因此其功能调控更可能依赖于蛋白质翻译后修饰。目前,蛋白磷酸化修饰在成熟精子中研究最为深入,其参与调控人精子运动、获能和顶体反应等多种功能。尽管赖
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当前不孕症已经是全球性问题,其中男性因素约占一半。精子活力低下是导致男性不孕症的主要原因之一,其发病机制复杂,涉及环境因素、遗传因素、病原菌感染、内分泌因素等多种原因,但具体分子病理机制不明。人成熟精子是转录沉默的细胞,其基因表达调控对精子的功能作用微弱,因此其功能调控更可能依赖于蛋白质翻译后修饰。目前,蛋白磷酸化修饰在成熟精子中研究最为深入,其参与调控人精子运动、获能和顶体反应等多种功能。尽管赖氨酸是翻译后修饰热点,但仅有赖氨酸甲基化和乙酰化修饰在成熟精子中有少量报道,其它赖氨酸翻译后修饰鲜有研究。赖氨酸巴豆酰化修饰(Lysine crotonylation,Kcr)是近年来发现的一种新型赖氨酸修饰。它通过在底物蛋白赖氨酸残基上加入一个巴豆酰基,中和赖氨酸上的正电荷,从而在电荷和物理性质上改变蛋白质结构调控蛋白质功能。Kcr是一种保守的蛋白质翻译后修饰,其在原核生物和真核生物细胞中广泛存在。小鼠睾丸精细胞中也存在Kcr,且在精子发生后期的精细胞中富集,但其在人成熟精子中尚未有报道。本文采用免疫印迹、免疫荧光、精子功能分析以及大样本筛查等实验在人成熟精子中系统研究了Kcr的定位、调控系统以及功能和可能调控机制。结果表明:1)人成熟精子中能检测到Kcr,存在于20-150 k Da的蛋白中,且与Hela细胞中的分布不同;巴豆酰化修饰蛋白主要定位在精子尾部;2)组蛋白酰基化酶P300抑制剂(C646)和组蛋白去酰基化酶Sirtuins抑制剂烟酰胺(NAM)分别降低和提高人成熟精子中Kcr含量,暗示P300和Sirtuins参与调控人成熟精子中Kcr;巴豆酸钠(Na Cr)能特异性增加人成熟精子Kcr含量,证明巴豆酰辅酶A同样是人成熟精子中巴豆酰化的酰基供体;3)利用Na Cr特异性增加人成熟精子Kcr后能增加人精子的前向运动率和穿粘液等运动能力;4)巴豆酰化蛋白质组学共鉴定出的1836个Kcr位点分布在645个蛋白上;GO和KEGG富集分析显示人精子中巴豆酰化修饰蛋白主要参与能量代谢等通路;5)大样本筛查结果表明弱精子症人精子中的Kcr含量显著低于正常人精子中含量(P<0.001),而正常人精子中Y染色质域蛋白(CDYL,具有巴豆酰辅酶A脱氢酶活性)的含量显著低于正常人精子中含量(P<0.001);通过Na Cr特异性提高Kcr含量下降的弱精子症精子中Kcr含量后能恢复这些病人精子前向运动率和ATP含量。综上所述,人精子中同样存在Kcr,其含量受调控酶(Sirtuins和P300)和辅因子(巴豆酰辅酶A)的调节。Kcr参与调控人精子运动,其含量下降可能是弱精子症的病因之一,且Kcr含量下降的弱精子症发病机制与CDYL含量增加和精子中ATP含量下降有关。
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