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前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是全球老年男性最多发的恶性肿瘤之一,其死亡率在男性恶性肿瘤中居第五位,在泌尿生殖系肿瘤中居第一位[1]。在我国由于缺乏有效的早期筛查手段,前列腺癌患者确诊时多数为晚期或已发生转移。因此探索研究快速的非侵入性的实验方法用于前列腺癌筛查和早期诊断迫在眉睫。外泌体（exosomes）是细胞分泌的纳米级的小囊泡,富含多种蛋白质、核酸和脂质等。其中研究最多的是核酸,而且主要是RNA,其表达量可以反映机体的生理病理状态。研究表明exosomes贯穿肿瘤发生、发展的各个时期,因此exosomal RNA具有作为肿瘤标志物的潜能。负载阳离子脂质体复合纳米颗粒（Tethered Cationic Lipoplex Nanoparticle,TCLN）芯片是exosomes检测的新技术,2015年由美国引进并获中国专利（ZL201310073081.3）,其最大的特点是对exosomes的原位检测,无需RNA提取和扩增,因此标本用量少、分析速度快、检测费用低,是exosomal RNA转化为临床检测方法较好的技术模型。因此,本研究拟通过采用TCLN技术检测前列腺癌患者血液及尿液exosomal RNA标志物,建立诊断模型,为PCa早期快速诊断提供新方法和新思路。基于此,我们进行了以下两部分研究:第一部分前列腺癌血清exosomal RNA标志物的筛选及TCLN芯片诊断方法的建立目的:筛选血液样本PCa与正常对照表达差异的exosomal RNA作为候选标志物,进行TCLN芯片检测并分析组间差异,建立诊断模型并评估其诊断效能。方法:通过文献检索结合前期研究基础,选定了8个exosomal RNA候选标志物,包括4个microRNA和4个mRNA。采用invitrogen沉淀试剂分离血清exosomes,透射电镜观察血清exosomes形态特征,NTA检测exosomes浓度和粒径大小,用DLS检测exosomes电位,用qRT-PCR验证上述候选exosomal RNA标志物在21例PCa、20例良性前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia,BPH）患者及16例正常对照组中的表达;用TCLN芯片检测上述标志物在44例PCa、40例BPH患者及36例正常对照组中的表达。两组间均数比较采用非参数Mann-Whiteney U检验,P<0.05时差异有统计学意义,构建ROC曲线,评估各个候选标志物区分PCa与正常对照的能力,构建诊断模型并评估诊断效能。结果:1、血清exosomes的提取和鉴定:采用invitrogen沉淀试剂分离的血清沉淀物,粒径大小在30150 nm,大小均一,粒径分布最大峰为99 nm,均带负电荷,表达exosomes特异蛋白ALIX和CD63,符合exosomes特征。2、经小样本量qRT-PCR验证,与正常对照组相比,血清exosomal miR-141、miR-375、miR-21、PCA3 mRNA的表达在PCa组显著升高,P值均小于0.05。3、采用TCLN芯片检测血清候选exosomal RNA标志物后发现miR-141最优,既可区分PCa和健康人群（P<0.01,AUC=0.709）,也可区分PCa和BPH（P<0.01,AUC=0.719）。4、采用TCLN芯片检测血清候选exosomal RNA标志物后发现PCA3 mRNA、PSAmRNA、let-7c、miR-375可用于区分PCa和健康人群（P<0.05,其中let-7c和miR-375的AUC<0.7）,但不能区分PCa和BPH（P>0.05）。5、选取miR-141、PCA3 mRNA、PSA mRNA三个标志物联合建立模型,诊断PCa的AUC=0.800,敏感性为81.8%,特异性为72.4%。结论:TCLN芯片检测8种候选exosomal RNA标志物,经统计分析后利用组间差异明显的3种RNA标志物（miR-141、PCA3 mRNA、PSA mRNA）初步建立PCa诊断模型,AUC=0.800,具有潜在诊断价值。第二部分前列腺癌尿液exosomal RNA标志物的筛选及TCLN芯片诊断方法的初步探讨目的:筛选尿液样本PCa与正常对照表达差异的exosomal RNA作为候选标志物,进行TCLN芯片小样本量检测并分析组间差异,探讨其用于PCa诊断的潜在价值。方法:通过文献检索结合前期研究基础,选定尿液第一批exosomal RNA候选标志物有8个,包括4个microRNA和4个mRNA,第二批包括8个microRNA。对尿液exosomes纯化方法进行优化,建立了“先浓缩后沉淀”的方法,用透射电镜、NTA和DLS检测exosomes形态、浓度和粒径大小以及电位。确定分离的为exosomes后,进一步明确反复冻融和冷冻时间对exosomal RNA含量的影响。采用qRT-PCR初步验证第一批候选标志物在12例PCa、12例BPH患者及15例正常对照组中的差异表达。用TCLN芯片初步检测上述候选exosomal RNA标志物在20例PCa、20例BPH患者及19例正常对照组中的表达水平。非参数Mann-Whiteney U检验分析两组间差异。结果:1、采用优化的方法与传统沉淀法分离相同来源的尿液exosomes,形态、粒径大小和浓度没有明显不同,且经Western blot鉴定优化方法提取到的沉淀物符合exosomes特征。2、用“浓缩+沉淀”方法提取13例尿液样本的exosomes,经NTA检测exosomes浓度为6.3×1010(1.8×10101.75×1011)particles/mL。3、尿液exosomes反复冻融后其RNA含量逐渐降低,经过5次冻融后其exosomallet-7c、PSA mRNA含量比新鲜exosomes显著降低,P值分别为:0.019、0.018。4、qRT-PCR初步验证尿液第一批候选exosomal RNA标志物:1)与正常对照组相比,PCa组尿液exosomal miR-21、PCA3 mRNA和T1-E2 mRNA的表达均升高,P值分别为:0.0303、0.0060和0.0480;2)与正常对照组相比,PCa组尿液exosomalmiR-375、let-7c和miR-141的表达均降低,P值分别为:0.0452、0.0042和0.0347;3)PCa组尿液exosomal PSA mRNA和T1-E4 mRNA的表达与正常对照组相比均无显著差异。5、TCLN芯片检测20例PCa、20例BPH及19例健康对照人群尿液第一批exosomalRNA,与正常对照组比较,exosomal miR-375和let-7c在PCa组明显降低,P值均小于0.05,初步显示出诊断潜能;与BPH组比较,exosomal miR-375在PCa组的表达是降低的,P<0.001,而其余6个标志物的表达在3组间都均无统计学差异。结论:“浓缩+沉淀”的优化方法可以从尿液中稳定分离exosomes,并且分离的exosomes可在-80℃短时间稳定保持,但应避免反复冻融;用TCLN芯片检测尿液第一批候选exosomal RNA标志物的表达,PCa组let-7c、miR-375表达降低,初步显示出诊断潜能。