论文部分内容阅读
人NDRG2（human n-myc downstream regulated gene2, hNDRG2）基因为我国第四军医大学首次发现，已被Genbank收录，登陆号为AFI59092，经原位杂交实验证实，NDRG2 mRNA在正常组织内广泛表达，并在部分肿瘤存在表达差异，推断其可能是抑癌基因，但是对这个基因的准确的作用机理和方式还有待于研究。 本实验将NDRG2基因克隆进PQE30／M15表达载体，经DNA测序证明构建正确，IPTG诱导表达，SDS-PAGE证实表达蛋白分子量符合预期。采用快速稀释方式进行蛋白复性，采用脱盐柱脱盐后，采用亲和层析纯化制备高纯度的蛋白。测定纯化产物的等电点为6.3。蛋白N端测序证实表达蛋白N端氨基酸序列正确。通过设置不同浓度的蛋白剂量并设置不同对照组，采用细胞MTT比色法和细胞计数检测考察NDRG2蛋白对7901、HHCC肿瘤细胞的抑制效果，流式细胞仪检测细胞周期的变化，体内实验采用裸鼠抑瘤试验，实验证实重组人NDRG2对肿瘤细胞有较强的抑制作用，并引起细胞G1期变化，体外能抑制裸鼠肿瘤的生成。 此外，本实验还构建了表达NDRG2的真核表达载体，以及含有针对NDRG2的shRNA的表达质粒，目的是通过增加或抑制NDRG2的表达研究NDRG2表达变化后细胞功能的变化，我们采用PCR方法从人基因组DNA中扩增出336bp的U6启动子，与29bp的NDRG2靶序列的反向重复序列和pSNAV质粒相连，连接后的pSNAVU6质粒转染入HHCC细胞，检测它对NDRG2表达的影响，结果显示针对NDRG2的短的发夹RNA能抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达，并引起被转染细胞G1期的延迟，通过软琼脂集落生成试验和裸鼠抑瘤实验证实被转染细胞集落生成能力减弱，裸鼠肿瘤生长速度比对照组也明显降低。 第四军医大学博士学位论文 通过本研究发现，重组NDRGZ蛋白能够影响肿瘤细胞细胞周期，抑制细胞增殖，而抑制内源性NDRGZ的表达获得相似的结果，推测NDRGZ序列中可能存在一种核锚定序列引起蛋白在细胞内外功能的差异。 最后，我们还针对NDRGZ的表达和抑制进行了肿瘤发现者和凋亡相关基因的基因芯片实验研究，结果发现NDRGZ的表达高低没有出现肿瘤细胞凋亡现象，而与肿瘤发生通路的基因存在一定关系，NDRGZ与P21呈负调控作用，可能通过促进血管生成因子受体Tie一2上调而促进癌生长，NDRGZ与CD4OL可能是负调控关系。在细胞内NDRGZ一定程度上表现出癌基因的特征，我们还需要更多实验去阐明其中机理。