【摘 要】
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2-苯乙醇（2-phenylethanol,2-PE）是一种具有玫瑰香气的芳香化合物,由于其稳定的性质和持久柔和的香气而被作为香精配方广泛应用于日用化学和食品工业中。微生物发酵法生产2-苯乙醇具有天然安全、副产物少等优点,逐渐成为高品质2-苯乙醇的主要生产方式。巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）是一种优良的外源蛋白生产菌株,同时它还是一种甲基营养酵母,具有天然利用甲醇的能力
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2-苯乙醇（2-phenylethanol,2-PE）是一种具有玫瑰香气的芳香化合物,由于其稳定的性质和持久柔和的香气而被作为香精配方广泛应用于日用化学和食品工业中。微生物发酵法生产2-苯乙醇具有天然安全、副产物少等优点,逐渐成为高品质2-苯乙醇的主要生产方式。巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）是一种优良的外源蛋白生产菌株,同时它还是一种甲基营养酵母,具有天然利用甲醇的能力。甲醇成本低廉,来源广泛,是一种富有潜力的碳源。随着近年来基因操作工具的发展,毕赤酵母被用于发酵生产多种化学品,其作为代谢产物生产工厂的潜力被不断挖掘。基于此,本研究以毕赤酵母GS115为研究对象,利用代谢工程方法对其2-苯乙醇合成途径进了理性改造,最终首次实现了毕赤酵母以甲醇为碳源合成2-苯乙醇。具体如下:（1）建立了一种毕赤酵母多基因组装系统。该系统基于golden gate克隆方法,引入了自主复制序列CEN/ARS、Cre/lox系统等元件,用于调整目的基因的表达方式及回收抗性。使用该方法构建质粒可通过直观的荧光变化筛选到阳性克隆,目的基因的启动子、终止子、整合位点均可灵活调整。（2）通过引入抗反馈抑制的异源酶赋予毕赤酵母以甲醇为碳源合成2-苯乙醇的能力。通过游离表达比较了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）来源的DAHP合酶(Aro4K229L)和分支酸变位酶(Aro7G141S)及大肠杆菌（Escherichia coli）来源的DAHP合酶(Aro GD146N、Aro GL175D)和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶(Phe Afbr)。（3）将莽草酸途径中的各基因进行系统过表达以寻找关键酶,最终选择了五功能酶Aro1p、DHAP合酶Aro3p和Aro5p进行组合过表达。（4）对前体物质4-磷酸赤藓糖的供应进行了优化,比较了改造内源的磷酸戊糖途径和引入外源的磷酸乙酮醇酶途径两种策略。（5）敲除氨基酸转氨酶基因Aro8同时过表达酿酒酵母来源的苯丙酮酸脱羧酶基因Aro10,以增加苯丙酮酸向2-苯乙醇的通量。结合以上改造的毕赤酵母菌株PP-PE21,在以甲醇为碳源的基础培养基中,合成了734.77 mg·L-12-苯乙醇,是出发菌株的18.3倍以上。综上所述,本研究建立了毕赤酵母多基因组装系统,并利用该系统对毕赤酵母莽草酸途径、磷酸戊糖途径和2-苯乙醇下游合成途径进行了改造,最终获得了能够利用甲醇从头合成2-苯乙醇的毕赤酵母菌株。本研究为2-苯乙醇高产菌株的构建提供了参考,并为毕赤酵母代谢工程生产芳香族化合物提供了重要依据。
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