登革热是由登革病毒感染所造成的,是主要流行于热带和亚热带地区的常见人类传染病。全球每年大约有1亿登革感染患者,登革热严重威胁着100多个国家约25亿人的健康。随着气候及现代交通方式的改变,登革热的流行在地理与季节方面均呈蔓延、扩展态势,使之成为了人类重大公共卫生问题。在我国,近年登革热疫情呈现上升趋势。广州几乎每年都有流行,每3～5年出现一次大流行,目前累计发病人数约占广东省70%左右。广州已成为全国登革热防控的重点地区。2009年世界卫生组织把登革热分为无预警指征非重症登革热[non-severe dengue without warning signs NSD(WS-)]、合并预警指征非重症登革热[non-severe dengue with warning signs NSD(WS+)]和重症登革热[severe dengue SD]三类。多数患者表现为普通登革热,多具发热、乏力、头痛、全身肌肉、骨骼和关节疼痛、白细胞及血小板计数降低等复杂多样的全身性症状,可自愈。大部分患者第3～6天在颜面四肢出现充血性皮疹或点状出血疹,也可出现不同程度的出血现象。发展为重症登革热的少数患者可因毛细血管通透性增加导致显著的血浆渗漏,并进一步造成血浆容量严重缺乏,患者可因此发生休克。长时间休克患者可发生代谢性酸中毒、多器官功能障碍。重症登革热常因出现心肌炎、中毒性肝炎、电解质及酸碱失衡、急性血管内溶血等并发症,而预后较差。全球每年有约2万人死于重症登革热。病毒性心肌炎是由病毒感染引发的心肌炎症反应,它以心肌变性、坏死为特征,并伴间质水肿、纤维化等临床病理学特征。登革病毒是一种公认的能引起病毒性心肌炎的病原体。据报道,一般各种病毒感染的人群中大概有1%～5%的病例会累及心肌,登革病毒感染患者中心肌炎的患病率9%至15%不等。作为登革热患者的主要并发症之一,心肌炎造成的心肌损伤常引起患者出现胸闷、心悸、头晕、气促、呼吸困难等临床症状。心肌炎是重症登革热患者死亡的一种常见原因。病毒性心肌炎发生发展的病理生理机制不详。有研究者认为病毒在宿主心肌细胞中的大量复制直接损伤心肌结构及功能,另有一些学者认为免疫损伤机制在病毒性心肌炎中发挥重要的作用。究其原因,一方面是由于病毒性心肌炎的临床表现多样化。病毒性心肌炎病情严重程度不一,可从非特异的心电图异常、轻度病毒感染前驱症状到急性血流动力学损害或猝死。病毒性心肌炎患者可表现出包括心动过速、心尖第一心音明显减弱、舒张期奔马律、心包摩擦音、心脏扩大、充血性心衰或阿斯综合征等多种临床表现。另一方面,辅助诊断表现多样化、诊断标准有待进一步成熟。心内膜心肌活检是诊断心肌炎的金指标,然而由于其具有一定的操作风险而难于普及。目前,指南推荐使用心电图、心脏影像学检查、血清学检查等多种辅助诊断作为心内膜心肌活检的替代,综合运用于心肌炎诊断。由于登革病毒感染与流行的整体发生率不高,而且受季节性、地域性因素影响明显,登革病毒性心肌炎的研究可用病例数就更为稀少。到目前为止,国内外有关登革热性心肌炎的发病率仍没有大型研究数据报道。为了明确登革病毒性心肌炎的临床发病和诊断特性,有必要对登革病毒性心肌炎进行系统地研究,这对于更好地防治重症登革热、减少患者死亡率至关重要。2014年,在广州市及其周边地区发生了过去20年来中国最严重的登革热疫情。大量登革病毒性心肌炎病例为本研究提供了难得的机遇,本研究根据2013年ESC最新的病毒性心肌炎诊断标准,对登革热住院患者进行系统地研究,从住院的1782例登革热患者中筛选出合并心肌炎的患者,拟从登革热的症状分布特点、实验室检查异常情况、心律失常及心力衰竭特点,患者心肌炎病情与登革热病情的关系等多个方面阐明登革病毒性心肌炎的疾病特征,并初步探索其发生发展的可能性机制,以期为临床预防与诊治提供科学依据。第一部分:登革病毒性心肌炎患者基本临床特征的研究1.材料与方法施(1)本研究中的所有数据均来自于广州市第八人民医院在2014年8月至10月间收治的登革热患者。所有患者入院当天采血,其后每日清晨空腹平卧采血,隔日1次分别送检血常规及血液生化项目。(2)登革热诊断标准:凡符合登革热临床表现,有流行病学史(发病前15天内到过登革热流行区,或居住地有登革热病例发生),或有白细胞和血小板减少者,定义为登革热疑似病例。对所有疑似病例使用相应种类的PANBIO公司ELISA试剂盒检测患者急性期和恢复期血清中登革特异性IgM抗体、IgG抗体或登革病毒NS1抗原,并根据公式计算效价(PANBIO单位);使用QIAGEN公司的病毒RNA抽取试剂盒从血清样本中提取登革病毒RNA。以登革病毒RNA为模板进行两轮巢式反转录PCR反应,第一轮PCR用于判断是否登革病毒感染,第二轮PCR用于判断是何种血清型的登革病毒感染。疑似病例若有白细胞、血小板同时减少,单份血清登革病毒特异性IgM抗体阳性或急性期血清检测出NS1抗原/病毒核酸等情况均可作出登革热确诊。经确诊的登革热患者,在急性期(<7天)IgG抗体阳性和在恢复期(≥7天)的IgM抗体/IgG抗体比例<1.2的被定义为继发性感染。(3)心肌炎的诊断标准:所有入选的登革热患者都进行心电图(electrocardiogram,ECG),超声心动图(μltrasound cardiogram,UCG)和心肌酶检测(cardiac enzyme test,CET)。根据欧洲心脏病学会的诊断标准(2013年)作出相应心肌炎诊断。有1种或以上临床表现的,并且伴有辅助检查中的1项或以上异常者,符合项目越多越支持诊断。如患者无症状,则需具备辅助检查2项或以上异常方可诊断。(4)排除标准:本研究排除既往心肌炎、心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭、风湿性心脏瓣膜病、心脏神经官能症和先天性心脏疾病等病史,自身免疫性疾病患者及孕妇也被排除在外。(5)统计学分析使用SPSS19.0进行统计学分析。定性变量通过病例数和百分数描述。3.结果:(1)根据WHO(2009)的诊断标准,从2014年8月至10月,共有1782例确诊的登革热患者住院。其中,我们共发现了 449例ECG异常,247例CET异常,139例UCG异常。根据欧洲心脏病学会(2013年)的诊断标准,本研究共确诊201例登革病毒性心肌炎,在此次流行的登革热住院患者群中心肌炎的患病率为 11.28%(201/1782)。(2)在全部201例登革病毒性心肌炎患者中,ECG异常、UCG异常和CET异常的患者分别为153例、83例和130例。这3种辅助诊断方法中,ECG是诊断心肌炎最灵敏的方法,敏感性为76.122%(153/201),而CET和UCG则分别为 64.68%(130/201)、41.29%(83/201)。(3)在全部201例登革病毒性心肌炎患者中的有心肌炎症状者中,只有ECG、UCG和CET中一项异常者分别为19例、4例和39例;兼有ECG合并UCG异常、ECG合并CET异常、UCG合并CET异常的患者分别为74例、86例和31例;ECG、UCG与CET三者均有异常的患者为26例。(3)NSD(WS+)/SD在ECG异常的登革病毒性心肌炎患者中的比例为11.11%(17/153),在UCG异常的登革病毒性心肌炎患者中的比例为6.02%(5/83),在CET异常的登革病毒性心肌炎患者中的比例为20.77%(27/130)。4.小结:(1)76.12%的登革病毒性心肌炎患者表现出心电图异常。(2)本次流行的登革热住院患者中心肌炎的患病率为11.28%(201/1782)。(3)心电图异常者占登革热住院患者比例为25.20%(449/1782),远远高于既往报道的数据,提示2014年爆发于广东的登革热较往年有更高的心电图异常比例。第二部分:合并心肌炎对患者登革热病情发展的影响研究1.目的:本研究入选了 201例登革病毒性心肌炎患者及150例登革热不合并心肌炎患者,对比两组患者之间一般资料、临床症状及辅助检查之间的差异,并探究这些差异是否与合并心肌炎有关。2.材料与方法(1)登革热诊断标准与方法同第1部分。(2)心肌炎诊断标准与方法同第1部分。(3)生命体征采集。(4)血常规及生化指标的测定。(5)统计学分析:使用SPSS19.0.1 for Windows(IBM公司,纽约州,美国)进行统计学分析。定性资料用病例数和百分比描述,组间比较采用四格表的卡方检验。定量资料用均数±标准差来描述,两组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。(6)入选标准:根据指南的诊断标准,本研究共确诊了201登革病毒性心肌炎病例作为研究组,另外随机抽取同时期入院的150例不合并心肌炎的登革热患者作为对照组。3.结果:(1)201例登革病毒性心肌炎患者及105例不合并心肌炎患者相比,两组在年龄、性别及登革热的病原学诊断阳性率等方面均没有显著差异。另外,两组在是否为二次感染比例上也没有统计学差异,提示心肌炎易感性与是否二次感染无相关性。(2)登革病毒性心肌炎患者NSD(WS+)/SD比例较对照组显著性升高(17.41%vs.2%,χ2 =21.137,P<0.001),提示合并心肌炎组患者更易出现较为严重的、需要着重加强诊治护理的登革热类型。(3)合并有心肌炎的登革热患者中休克发生率显著高于对照组(14%vs.1%,χ2=8.330,P=0.004)。此外,合并心肌炎的登革热患者比没有合并心肌炎的登革热患者具有更高的出血、抽搐、昏迷和失语的发生率,但无统计学差异。(4)与不合并心肌炎的登革热患者相比,合并心肌炎的登革热患者有显著增高的谷草转氨酶(399.71 ± 1064.56 vs.163.12 ± 122.31,t=3.123,P=0.002)和AST/ALT 比值(1.95±1.10vs.1.64±0.95,t=2.812,P=0.005)。(5)与不合并心肌炎的登革热患者相比,合并心肌炎的登革热患者有较低的血红蛋白(115.29±22.996vs.127.61 ±14.95,t=-6.106,P<0.010)和红细胞压积(39.01±5.61 vs.41.20±8.23,t=-2.810,P<0.050),以及更高水平的收缩压(115.98±18.01 vs.109.43 ±14.30,t=3.668,P<0.010)和肌酐水平(103.05± 67.65 vs.84.44 ±25.12,t=3.582,P<0.001)。4.小结(1)在年龄、性别、登革热病原学诊断阳性率及是否二次感染方面一致的前提下,合并心肌炎组的NSD(WS+)/SD比例及休克患者比例较对照组显著性升高。(2)谷草转氨酶作为心肌酶的指标,在心肌细胞中含量最高,合并心肌炎组的谷草转氨酶较对照组显著性升高,提示合并心肌炎组的心肌细胞损伤坏死较对照组严重。(3)登革病毒性心肌炎患者具有更低的血红蛋白和红细胞压积,更高的肌酐水平。(4)登革病毒性心肌炎患者较对照组收缩压更高,其病理生理意义有待于进一步更加深入的研究。第三部分:不同程度登革热患者中心肌炎的临床特征比较研究1.目的:与NSD(WS-)相比,NSD(WS+)/SD患者究竟哪些心肌炎相关异常指征较为突出,这些指征分布有哪些特点,心肌炎随着患者登革热轻重程度差异又如何变化,目前国内外仍没有与之相关的数据。本部分拟从心肌炎相关临床症状分布、辅助检查、心律失常及心力衰竭发生率等数个方面比较NSD(WS-)与NSD(WS+)/SD两组患者之间的差异,明确不同严重程度的登革热性心肌炎患者在心肌炎指标变化上的相似点与不同点。2.材料与方法:201例登革病毒性心肌炎病例根据WHO(2009)指南的重症登革热诊断标准,分为两组:NSD(WS-)组共166例,NSD(WS+)/SD组共35例。3.结果:(1)对患者心肌炎临床症状的分析NSD(WS+)/SD组患者的呼吸困难、心悸、黑蒙、休克与(顿挫)SCD等临床症状的发生率高于NSD(WS-)组。(2)对患者辅助诊断指标的分析两组的心电图异常及心肌酶异常均无统计学差异。在NSD(WS-)组患者中有更多的患者存在心腔扩大(24.7%VS8.6%,χ2=4.397,P=0.036)和瓣膜返流(34.94%VS5.71%,χ2=11.79,P=0.001),差异具有统计学意义。这两个不同严重程度的登革热患者群之间的其他超声心动图表现无统计学显著差异。(3)对患者心律失常指标的分析在全部201例登革病毒性心肌炎患者中,合并心律失常患者有113例,合并心力衰竭患者共51例,分别占心肌炎患者的56.22%、25.37%。在这两个组中的患者中均有发现窦性心律不齐、室性心律失常、室上性心律失常和传导阻滞等多种心律失常类型。与NSD(WS-)组相比,NSD(WS+)/SD组的心房纤维颤动(10.24%vs.25.71%,χ2=0.023,P=0.019)和室上性心动过速(0%vs.14.29%,χ2=0.000,P<0.001)的发生率显著性增加,差异有统计学意义。(4)对患者心力衰竭指标的分析随登革热病情的加重大多数心力衰竭指标如呼吸频率、心源性休克、奔马律、双侧肺啰音、血氧分压、肺淤血等加重。但是,左室射血分数、舒张末期内径、AVB(Ⅱ和Ⅲ)、QRS宽度、CK-MB、NT-proBNP等在不同严重程度登革热病情的患者群之间却没有统计学显著差异。4.小结(1)与NSD(WS-)患者相比,NSD(WS+)/SD患者的呼吸频率,双侧肺罗音,奔马律,胸部X线显示的肺淤血等几个心力衰竭相关指标均升高。这表明,在登革热感染导致的心肌损伤随着登革热疾病的加重而增加。(2)NSD(WS+)/SD患者群与NSD(WS-)患者群相比,室上性心动过速和心房纤维性颤动发生率显著性增加。第四部分:登革病毒性心肌炎的初步病理学研究1.目的:登革病毒是一种公认的引起病毒性心肌炎的病原体,心肌炎是重症登革热患者死亡的一个特别常见的原因。但是,人们对登革病毒引起病毒性心肌炎的具体机制还知之甚少。为了更好地理解登革病毒性心肌炎临床发病的病理生理机制,我们利用ELISA方法测定了血浆中的炎症相关的细胞因子,并通过对尸检组织进行的心肌组织病理学分析,初步探索了登革病毒性心肌炎发生发展的可能性病理生理机制。2.材料与方法:(1)组织病理学分析对一例因心源性休克死亡患者进行心肌组织病理学检查。PBS洗去组织上的血污,常规4%多聚甲醛固定、脱水、石腊包埋后切片。经HE染色后,在普通光学显微镜下观察心肌组织病变情况。(2)细胞因子的测定选取21例合并心肌炎的登革热患者和20例不合并心肌炎的登革热患者进行对照研究。患者于清晨安静平卧状态下,空腹静脉采血,采用放射免疫分析法检测血中白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2),白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10),肿瘤坏死因子-α(necrotic factor-α,TNF-α)的水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测单核细胞趋化因子-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1)和基质金属蛋白酶 9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)的水平。均按试剂盒说明书进行操作。3.结果:(1)重症登革热患者心肌组织病理学分析病理学HE染色发现,心肌细胞发生明显的变性,并出现了明显的间质水肿,血管周围存在炎性细胞浸润,浸润细胞以淋巴细胞为主。(2)登革病毒性心肌炎患者的血液细胞因子水平的改变合并心肌炎的登革热患者血清中TNF-α(7.61±1.34vs.6.48±0.88,t=2.594,P=0.016),MCP-1(510.93±416.30 vs.245.92±149.76,t=2.737,P=0.011)和MMP-9(313.81±286.08vs.117.91±149.82,t=2.765,P=0.010)的水平显著高于对照组。但IL-2,IL-6,IL-8和IL-10等的水平在两组之间无统计学显著差异。4.小结(1)登革病毒是一种新发现的病毒性心肌炎的病原体。到目前为止,很少有登革热病毒直接感染心肌细胞的证据,可能是由于登革病毒对心肌细胞的嗜性较低的原因。我们对重症心肌炎患者尸检心肌组织进行病理学分析发现了心肌细胞的变性、间质水肿与炎性浸润的发生。提示,登革热心肌损伤的主要机制可能是炎症因子介导的心肌损伤,而不只是病毒对心肌细胞的直接攻击。(2)合并心肌炎的登革热患者血清中炎症细胞因子TNF-α,单核细胞趋化因子MCP-1和基质金属蛋白酶MMP-9的水平显著增高。