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第一部分Mi R-155参与TGF-β1诱导足细胞损伤的作用研究目的:探讨mi R-155在mi R-155mimics和mi R-155 inhibitor转染足细胞后的表达变化及稳定情况,mi R-155表达变化在TGF-β1诱导足细胞损伤过程中对足细胞标志蛋白的影响。方法:(1)体外培养条件永生化小鼠足细胞系MPC5,细胞免疫荧光染色法鉴定足细胞分化成熟;(2)用12ng/m L TGF-β1处理足细胞72h,构建足细胞损伤模型,RT-q PCR和Western blot法分别检测mi R-155和CD2AP、synaptopodin的表达;(3)用免疫荧光显微镜观察不同LipofectamineTM2000剂量转染不同浓度Cy3 mi R-155 NC 24h后的荧光效果,再用RT-q PCR法检测转染不同浓度、不同时间mi R-155mimics和inhibitor后mi R-155的表达;(4)将细胞随机分为:Normal组、TGF-β1组、mimics+TGF-β1组、mimics NC+TGF-β1组、inhibitor+TGF-β1组、inhibitor NC+TGF-β1组,RT-q PCR法检测mi R-155的表达,RT-q PCR及Western blot检测podocin、CD2AP、synaptopodin的表达,细胞免疫荧光染色法观察CD2AP的荧光表达和分布。结果:CD2AP、synaptopodin免疫荧光呈足细胞分化成熟的特征分布。TGF-β1干预后mi R-155表达上升,CD2AP、synaptopodin蛋白表达下降(P<0.01)。达到一定剂量的Lipofectamine TM2000足以饱和不同浓度的mi RNA,并将不同浓度Cy3 mi R-155NC成功转入足细胞内,且转染效率达80%以上。RT-q PCR结果显示,转染mi R-155mimics、mi R-155 inhibitor 24h后,与阴性对照组(NC)比较差异有统计学意义,mi R-155mimics转染浓度80nmol/m L时mi R-155在足细胞中的表达上升较明显(P<0.01),mi R-155 inhibitor转染浓度150nmol/m L时mi R-155表达下调较明显(P<0.01)。mi R-155 mimics或mi R-155 inhibitor转染TGF-β1干预的足细胞48、72 h后,mi R-155表达明显增加或减少(P<0.01),mi R-155 mimics+TGF-β1组与TGF-β1组、NC+TGF-β1组比较,mi R-155表达上升(P<0.01),podocin、CD2AP、synaptopodin的m RNA和蛋白表达下降(P<0.01),而转染mi R-155 inhibitor对足细胞的作用与mi R-155 mimics相反。免疫荧光结果显示CD2AP蛋白的表达与Western blot、RT-PCR结果一致,其分布也随mi R-155的表达变化而改变。结论:mi R-155可参与TGF-β1诱导的足细胞损伤,其作用机制有待于进一步探讨。第二部分Mi R-155通过α3β1/FAK/Rho A/ROCK通路调控TGF-β1诱导的足细胞损伤目的:研究整合素α3β1/FAK/Rho A/ROCK骨架蛋白信号传导通路在TGF-β1损伤足细胞中的作用关系;探讨Mi R-155是否通过整合素α3β1/FAK/Rho A/ROCK骨架蛋白通路调控TGF-β1诱导的足细胞标志蛋白损伤、足细胞迁移和F-actin细胞骨架紊乱。方法:(1)12ng/m L TGF-β1刺激足细胞后,在不同时间点用Western blot法检测FAK/Rho A/ROCK通路激活的时间效应情况;(2)细胞随机分为正常对照组、TGF-β1处理组、FAK inhibitor+TGF-β1组、Rho A抑制剂C3+TGF-β1组,用Western blot检测TGF-β1、FAK抑制剂、Rho A抑制剂对足细胞通路a3β1/FAK/Rho A/ROCK的影响。;(3)用免疫共沉淀检法检测β1与FAK、β1与Rho A的互作关系;(4)RT-q PCR检测Rho A抑制剂对TGF-β1诱导mi R-155表达的影响;(5)将细胞随机分为:Normal组、TGF-β1组、mimics+TGF-β1组、mimics NC+TGF-β1组、inhibitor+TGF-β1组、inhibitorNC+TGF-β1组、C3+TGF-β1组,用RT-q PCR、Western blot、划痕实验、Transwell实验、细胞骨架免疫荧光染色方法,检测mi R-155表达变化及Rho A抑制剂C3对TGF-β1诱导α3β1/FAK/Rho A/ROCK通路激活,标志蛋白α-actinin-4、nephrin损伤以及足细胞迁移、F-actin细胞骨架紊乱的影响。结果:(1)与0h相比较,FAK和ROCK1活性相关蛋白MYPT在TGF-β1刺激30min后磷酸化水平均开始上升,在12小时达到较高水平,而Rho A活性在TGF-β1刺激30min后也明显上升,1小时后最明显,差异均有统计学意义(P<0.01);(2)抑制FAK Y397磷酸位点或抑制Rho A GTP后,阻止了TGF-β1对足细胞αβ1/FAK/Rho A/ROCK通路的激活,p-FAK、active Rho A、ROCK的表达水平明显下降,β1的表达水平恢复升高,差异均有统计学意义(P<0.01);(3)免疫共沉淀证明了TGF-β1增强了β1与p-FAK、β1与active Rho A的互作关系;(4)与TGF-β1组相比,C3+TGF-β1组中mi R-155的表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);(5)mi R-155过表达可使TGF-β1诱导的α3β1/FAK/Rho A/ROCK活性进一步增强,进而触发α-actinin-4、nephrin表达下降,足细胞迁移率增加,F-actin细胞骨架紊乱明显;Rho A抑制剂与mi R-155 inhibitor作用相似,不仅抑制Rho A信号通路转导,且都可以下调mi R-155表达,同时阻止TGF-β1激活α3β1/FAK/Rho A/ROCK通路,逆转TGF-β1诱导的α-actinin-4、nephrin表达降低、足细胞迁移和F-actin细胞骨架紊乱;差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)TGF-β1诱导足细胞整合素α3β1/FAK/Rho A/ROCK骨架通路激活,导致足细胞标志蛋白损伤、细胞迁移和细胞骨架紊乱,且信号通路分子之间具有相互协同作用;(2)Rho A信号通路转导与mi R-155的表达密切相关,mi R-155可通过α3β1/FAK/Rho A/ROCK通路调控TGF-β1诱导的足细胞损伤。