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作为一种分泌性糖蛋白,颗粒蛋白前体(Progranulin,PGRN)包含一个由17个氨基酸残基构成的分泌信号肽以及7.5个高度保守的半胱氨酸衔接重复结构域,这些结构域被分别命名为 paragranulin、granulinG、F、B、A、C、D、E。PGRN 广泛地分布于人体内的多种细胞、组织或器官中,尤其在如生殖系统、肺、肾以及皮肤等这些富含上皮细胞的组织或器官中分布较多。另外,在某些神经细胞以及大多数的肿瘤细胞中,PGRN也有较高的表达。目前的研究发现,PGRN涉及多种生理及病理活动,包括神经系统发育,炎症反应,伤口修复以及肿瘤的发生和发展等。但是,PGRN在各种生理或病理活动中发挥其生物学功能的分子机制至今尚未得到完整而清楚的解释。由于PGRN生物学功能的发挥依赖于它与相关蛋白质分子之间的相互作用,因此,寻找能与PGRN相互作用的蛋白质分子对阐明PGRN发挥其功能的分子机制具有重要的研究意义。本课题首先通过酵母双杂交系统筛选获得了可能与PGRN相互作用的蛋白质分子SLC39A6(即LIV-1或ZIP6),然后再利用该系统以及GST-Pull down实验技术对它们之间的相互作用进行了进一步的分析与验证,最后,利用慢病毒载体构建LIV-1-knockdown HepG2细胞系以及相应的对照细胞系,并利用PGRN siRNA降低所建立细胞系中的PGRN表达水平,然后通过Real-time PCR检测上皮-间充质细胞转化过程(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)中相关分子的 mRNA 表达水平。本课题具体研究内容包括以下几个方面:(1)利用酵母双杂交系统筛选与人PGRN相互作用的蛋白质分子:首先将本实验室已构建的酵母表达载体pGBKT7/PGRN no signal peptide转化入酵母菌AH109中,经检测确定融合蛋白BD-PGRN可以正常表达以后,利用该载体通过酵母双杂交系统从Human Leukocyte Matchmaker cDNA Library中筛选与人PGRN相互作用的蛋白质。通过测序分析,发现了一个新的可能与PGRN发生相互作用的分子,即锌离子转运蛋白LIV-1。(2)PGRN与LIV-1相互作用位点的鉴定:根据LIV-1结构及序列特点,推测其与PGRN可能发生相互作用的部位为富含组氨酸的最长胞外段及最长胞内段。因此本课题利用PCR的方法从人源的Mega ManTM cDNA Library中克隆获得LIV-1的最长胞外段(LIV-1 etcodomain)以及最长胞内段(LIV-1 intracellular domain)基因序列,并构建了酵母表达载体pGADT7/LIV-1 ectodomain stop 及 pGADT7/LIV-1 intracellular domain stop。然后将它们分别与酵母表达载体pGBKT7/PGRN no signal peptide共转化入酵母菌AH109中进行验证,结果表明,LIV-1 ectodomain 或 LIV-1 intracellular domain 与 PGRN在酵母细胞中存在相互作用。随后,通过基因缺失技术及酵母双杂交技术进一步研究分析 LIV-1 ectodomain 或 LIV-1 intracellular domain 与 PGRN 之间相互作用的结构域发现,PGRN与LIV-1的这两个结构域发生相互作用的主要位点为GrnB、A、C,同时,LIV-1两个结构域中的组氨酸富集区是它们与PGRN相互作用的关键区域。最后,利用GST-Pull down实验技术进一步验证了 LIV-1 ectodomain或LIV-1 intracellular domain与PGRN在体外存在相互作用。(3)初步探索LIV-1在PGRN介导的肝癌细胞侵袭过程中所发挥的功能:由于LIV-1及PGRN在肝癌细胞中的表达量都较高且二者都与肝癌细胞的侵袭过程相关,所以为了探究LIV-1在PGRN介导的肿瘤细胞侵袭过程中所发挥的作用,根据文献报道,本课题首先构建了携带有不同LIV-1 shRNA的慢病毒表达载体,经检测后,选择作用效果最优者用于构建LIV-1-knockdownHepG2细胞系,同时利用携带有control shRNA的慢病毒载体建立对照细胞系。经过不断筛选培养,成功获得了 LIV-1-knockdown HepG2细胞系以及对照细胞系。然后利用PGRN siRNA转染所构建的细胞系以降低PGRN的表达,并对EMT相关分子的mRNA表达水平进行检测。经检测发现,Snail、MMP9以及N-cadherin在LIV-1-knockdown HepG2、PGRN-knockdown HepG2 以及 LIV-1/PGRN double-knockdown HepG2 细胞中的表达水平都有明显降低,而有趣的是,除Snail以外,MMP9以及N-cadherin的mRNA表达水平在LIV-l-knockdown HepG2细胞中仍高于其他两个处理后的细胞系。这些检测结果提示PGRN与LIV-1可能通过相同的(如Snail)或者部分相同的(如MMP9及N-cadherin)途径促进肝癌细胞的EMT过程,并且在此过程中,PGRN很有可能起到主导作用。综上所述,本课题的研究获得了以下结果:(1)通过酵母双杂交系统筛选获得了一种新的与PGRN相互作用的蛋白质分子LIV-1;(2)通过酵母双杂交系统鉴定LIV-1与PGRN相互作用的位点:在LIV-1中为富含组氨酸的最长胞外段及最长胞内段,在PGRN中主要为GrnB、A、C,并通过GST-Pull down实验技术进一步验证了它们在体外的相互作用;(3)成功构建了 LIV-1-knockdown HepG2细胞系以及相应的对照细胞系,并通过siRNA干扰作用获得了 PGRN-knockdownHepG2以及LIV-1/PGRN double-knockdown HepG2 细胞。随后利用 Real-time PCR 检测所获得的HepG2细胞中EMT相关分子表达水平变化,结果提示PGRN可能通过与LIV-1相同或者部分相同的途径促进肝癌细胞的EMT转化过程,并很有可能起着重要的主导作用。本课题的研究结果为进一步阐明PGRN促进肝癌细胞恶性转变的分子机制提供了一条新的研究方向并奠定了一定的研究基础。