研究背景子宫颈癌(cervical cancer)是女性生殖系统第一大常见的恶性肿瘤,严重威胁女性生殖健康,其病因并不确切,目前认为与经济水平、吸烟、早产、多产、环境因素以及高危型人乳头瘤病毒(high-risk human pap illomavirus, HR-HPV)感染等密切相关,尤其是HR-HPV的慢性、持续性的感染成为导致宫颈癌发生的主要因素,如HPV16、HPV18型。但是其具体机制尚不清楚,普遍观点认为可能与HPVE6蛋白降解抑癌基因p53密切相关。在正常上皮细胞生长情况下,p53并不是细胞功能的必须蛋白,由于其半衰期较短,在细胞中含量较低,当细胞受到损伤或刺激时,p53蛋白就会被激活通过抑制细胞周期和促进细胞凋亡等方式对细胞进行修复。当宫颈上皮细胞感染HPV病毒后表达大量HPVE6蛋白,通过激活p53依赖HPVE6蛋白介导p53泛素化途径,使p53降解,导致受损的细胞进入细胞周期以及细胞的无限制增殖,诱使肿瘤的发生。因此使细胞内p53蛋白表达升高仍然是宫颈癌分子靶向治疗的一个重要研究方向,采用重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53)感染肿瘤细胞,使外源p53基因使其在细胞中高效稳定表达,并产生阻滞细胞周期、促进细胞凋亡和抑制细胞增殖等多方面的作用。随着另外两个p53家族成员的p73、p63的发现,众多学者开始意识到p53家族成员之一p63在调控肿瘤细胞分化、浸润以及转移方面发挥重要作用,可能在上皮来源的肿瘤的侵袭、转移以及复发等进展过程中起到了关键作用。作为p53家族的新成员,p63虽然在序列和结构上与p53具有很高的同源性,但是由于其还有较多的启动子和剪切方式的不同,因此,编码多种亚型蛋白,而这些亚型在不同组织和不同生物功能中发挥作用,但是关于p63的具体功能并不十分清楚,目前关于其功能主要报道如下：(1)组织生长发育：(2)调控细胞周期与细胞凋亡：通过病毒稳定表达TAp63亚型的细胞,发现TAp63能够阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,有趣的是△Np63则取得相反的实验结果,同时还发现TAp63或△Np63a在p53-/-细胞中能够调控p53的下游靶基因,这也增加了其研究的复杂性；(3)在肿瘤的转移和侵袭方面的作用：一方面：p63通过调控下调Snail、Slug以及ZEB1等上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关的锌指转录因子的表达,继而抑制EMT,抑制肿瘤细胞的侵袭、转移；另一方面：p63可以与Smad复合物结合,调控TGFβ诱导的肿瘤细胞的转移；(4)调控上皮分化：p63能够通过激活人类角质细胞中的各种分化基因启动子,从而调控细胞的分化,这也是p63最广为人知的生物学功能；(5)其他生物学功能：p63还在细胞增殖、肿瘤干细胞以及细胞耐药等方面发挥一定的作用。鉴于在宫颈组织中以△Np63α表达为主,在宫颈癌组织中由于TAp63蛋白的半衰期比较短,使其在宫颈组织中几乎检测不到,本研究采用p63α抗体对宫颈癌组织进行检测。90%以上的宫颈癌病理类型为鳞癌,因此本研究主要重于对鳞癌的研究。本文拟首先明确△Np63α在子宫上皮组织、子宫鳞状上皮组织中的表达以及其与EMT的关系；其次阐明△Np63α调控宫颈鳞癌EMT的具体机制。本研究分为两部分：第一部分：p63a在正常及宫颈鳞癌组织中的表达及其与EMT的关系第二部分：△Np63α重组慢病毒的构建及其抑制宫颈癌EMT作用机制研究第一部分p63α在正常宫颈及宫颈鳞癌组织中的表达及其与EMT的关系目的：1.研究宫颈鳞癌组织中EMT现象；2.研究p63a在正常子宫颈组织以及宫颈鳞癌中的表达水平；3.研究宫颈癌中p63α的表达与宫颈癌EMT的关系；4.探讨p63α在宫颈鳞癌中表达的临床意义；方法：选取安徽医科大学附属省立医院妇产科2000年1月至2003年12月的收治的128例字宫颈鳞状细胞癌患者,年龄29-66岁,中位年龄45岁,根据1994年FIGO分期,宫颈鳞癌Ⅰ期90例,Ⅱa期38例,所有宫颈鳞癌患者临床诊断均由两名高级职称的妇科医师参照2000年制定的FIGO标准为诊断依据,并且依据术后鳞癌组织病理诊断确诊,术前均为未接受任何辅助治疗并且随访资料完整。免疫组化法进行以下研究：①检测正常宫颈鳞状上皮组织、宫颈鳞癌组织中β-catenin.Vimentin的表达,进行相关性分析,证实宫颈鳞癌中是否存在EMT现象；②检测正常宫颈鳞状上皮组织、宫颈鳞癌组织中p63a的表达；③统计分析宫颈鳞癌p63a的表达与EMT的关系；④p63α宫颈鳞癌中表达的临床意义。结果1.β-catenin蛋白与Vimentin蛋白在正常宫颈鳞状上皮以及鳞癌组织中的表达情况正常子宫颈鳞状上皮细胞组织中β-catenin主要表达在细胞膜,在宫颈鳞癌组织表达在细胞膜和细胞质。β-catenin蛋白在正常宫颈鳞状上皮组织的高表达率为82.5%(33/40)、低表达率为12.5%(5/40),在宫颈鳞癌组织中的高表达率35.9%(46/128),低表达率为43.0%(55/128),β-catenin在宫颈鳞癌组织中的表达明显低于正常宫颈组,差异有统计学意义(P<0.05)；Vimentin在正常子宫颈鳞状上皮细胞组织几乎不表达,在宫颈鳞癌组织主要表达在细胞质。在宫颈鳞癌组织中的高表达率28.1%(36/128),低表达率为38.3%(49/128),在宫颈鳞癌组织中Vimentin的表达明显高于正常宫颈组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.宫颈鳞癌组织中β-catenin和Vimentin表达的相关性128例宫颈鳞癌组织,18.8%(24/128)的癌组织呈β-catenin高表达,Vimentin呈阴性表达；29.7%(38/128)呈β-catenin和Vimentin共同低表达；14.1%(18/128)呈β-catenin阴性表达,Vimentin高表达,采用Spearman检验β-catenin和Vimentin表达率的相关性,相关系数rs=-0.277,(P值=0.002),宫颈鳞癌组织中存在EMT现象。为了下一步研究,根据β-catenin以及Vimentin的表达将宫颈鳞癌组织分为三组：(1)不发生EMT组(24例)：β-catenin高表达,Vimentin呈阴性表达；(2)不完全发生EMT组(38例)：β-catenin低表达,同时Vimentin低表达；(3)完全发生EMT组(18例)：当β-catenin阴性,Vimentin高表达时。3.p63α蛋白在正常宫颈上皮以及宫颈鳞癌组织的表达情况p63α蛋白主要表达在细胞核中,在正常宫颈鳞状上皮组织中的高表达率为75.0%(30/40)、低表达率为15.0%(6/40),128例宫颈鳞癌组织43例高表达、60例低表达,表达率分别为33.6%和46.9%。p63α在宫颈鳞癌组织中的表达明显低于正常宫颈组织中的表达,差异有统计学意义(P<0.001)。4.宫颈鳞癌中p63α与EMT在128例宫颈鳞癌组织中,36例癌组织呈p63α蛋白与β-catenin皆高表达；32.0%(41/128)的宫颈癌组织中p63α与β-catenin低表达；10.9%(14/128)都是阴性表达,采用Spearman检验p63α蛋白与β-catenin表达率的相关性,相关系数rs为0.657,呈正相关性(P<0.001)。23.4%(30/128)的癌组织当p63α高表达时Vimentin不表达；24.2%(31/128)的癌组织p63α和Vimentin皆呈低表达状态。7.0%(9/128)呈p63α阴性表达,Vimentin高表达,采用Spearman检验p63α和Vimentin表达率的相关性,相关系数rs为-0.398,呈负相关性(P<0.001)。比较完全发生EMT组(18例)、不发生EMT组(24例)、不完全发生EMT组(38例)三组中p63α的表达发现,p63α表达逐渐升高,组与组之间差异皆有统计学意义(P值均<0.05)。5. p63α、β-catenin、Vimentin蛋白的表达与宫颈鳞癌患者临床特征相关性宫颈鳞癌组织中p63α、β-catenin、Vimentin的表达与患者的年龄、临床分期差异无统计学意义(P>0.05)；β-catenin、Vimentin的表达与鳞癌组织分级相关,p63α则无明显相关性,三种蛋白皆与患者是否淋巴结转移密切以及复发密切相关(P<0.05)。6. p63α、β-catenin、Vimentin蛋白的表达与宫颈鳞癌患者预后的相关性分析128例宫颈鳞癌患者10年随访结果显示,共计死亡23人,5年生存率90%,10年生存率81%,10年生存曲线。宫颈鳞癌患者中p63a高表达患者死亡率为9.3%(4/43),低表达p63α的患者病死率为15.0%(9/60),阴性表达p63α的患者病死率为40.0%(10/25);p-catenin强阳性表达的患者死亡率为8.7%(4/46),弱阳性表达的患者病死率为14.5%(8/55),阴性表达β-catenin的患者病死率为40.7%(11/27); Vimentin高表达的患者病死率为41.7%(15/36),弱阳性的表达患者病死率为10.2%(5/49),阴性表达Vimentin的患者病死率为7.0%(3/43)。分别对p63α、β-catenin、Vimentin三种蛋白进行Log rank检验(P=0.000；P=0.001；P=0.002),结果提示每种蛋白表达水平高低不同,生存率差异有统计学意义。7.影响宫颈鳞癌预后的单因素及多因素分析以年龄、FIGOI临床分期、分化程度、有无淋巴转移及复发为影响因子分析其对生存的影响,单因素Cox回归生存分析显示宫颈鳞癌组织分化程度低,淋巴转移,复发及Vimentin蛋白的表达为影响生存的危险因素,而p63α及β-catenin的表达为影响生存的保护因素(P<0.05)。将各因子进行多因素Cox回归生存分析显示,淋巴转移,复发,Vimentin蛋白高表达为影响生存的独立危险因素(P<0.05)。结论1.宫颈鳞癌组织存在EMT。2.p63α在子宫颈鳞癌组织中的表达显著降低,其表达水平与淋巴转移、宫颈癌复发密切相关。3.p63α与宫颈鳞癌EMT的发生密切相关。4.p63α低表达的宫颈鳞癌患者预后较差。第二部分△Np63α重组慢病毒的构建及其抑制宫颈癌EMT作用机制研究目的1.确定p63a在宫颈癌中以何种亚型表达为主；2.构建△Np63α重组慢病毒；3.确定ANp63α与宫颈癌EMT的关系；4.初步探讨△Np63α调控宫颈癌EMT作用机制；方法构建△Np63α重组慢病毒,感染宫颈癌C33A、SiHa细胞系,观察感染重组慢病毒前后细胞的生物学行为的改变以及其对宫颈癌细胞EMT的影响。结果1.p63α、△Np63. TAp63在正常宫颈鳞状上皮组织和宫颈鳞癌中的表达情况p63a在40例正常宫颈鳞状上皮组织中,30例高表达,6例低表达,而在128例宫颈鳞癌组织中43例高表达、60例低表达；△Np63在40例正常宫颈鳞状上皮组织中28例高表达、7例低表达,128例宫颈鳞癌组织中39例高表达、63例低表达；40例正常宫颈鳞状上皮和128例宫颈鳞癌组织中,无一例TAp63高表达,22例低表达,其余为阴性。在128例宫颈癌组织中,随机取10例p63a高表达、10例p63a低表达、10例p63a表达阴性的宫颈鳞癌组织,比较同一组织连续切片△Np63、TAp63染色结果发现：30例宫颈鳞癌组织,ANp63a抗体染色结果与p63a染色相同,且染色程度也较相似,而30例宫颈鳞癌组织中TAp63染色皆为阴性。2.△Np63a在HaCaT和宫颈癌细胞系中的表达通过qRT-PCR检测人永生化表皮细胞HaCaT和5株子宫颈细胞系中α亚型、△N亚型的p63mRNA片段,发现在人永生化表皮细胞HaCaT细胞和宫颈癌ME180细胞中α亚型、AN亚型表达相对较高,其余宫颈癌细胞株表达相对较低,进一步在6种细胞株中检测p63的△N亚型、TA亚型发现以△N亚型表达为主。通过Western bloting方法检测发现4A4抗体检测到p63在HaCaT、MS751、CaSki、ME180细胞中高表达,而在SiHa、C33A细胞表达较低,进一步通过α亚型、△N亚型、TA亚型的p63抗体检测,发现α亚型、△N亚型是p63在HaCaT、MS751、 CaSki、ME180田胞的主要亚型,这一结果同在正常宫颈鳞状上皮组织和宫颈鳞癌组织中检测结果相同,进一步验证了p63α蛋白在宫颈癌中以ANp63a蛋白表达为主。3.PCR获得目的基因片段琼脂糖凝胶电泳中获得1761bP目的基因片段,与TP63transcript variant4预期大小相符(扩增条带大概在Markerl500bp上一点的位置),表明TP63目的基因已成功扩增出来。4.双酶切成功构建重组体使用XhoI与BamHI将TP63PCR回收产物和pLVX-IRES-ZsGreenl载体双酶切,构建重组体pLVX-IRES-ZsGreenl+TP63transcript variant4。对双酶切产物和提取的质粒TP63transcript variant4以含溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖凝胶电泳分离,UVP凝胶成像系统成像,在相应的位置切出一条目的条带,与拟构建的融合蛋白之DNA片段大小的理论值一致。抽提后分装200ul重组质粒送至金唯智基因公司测序,测序结果通过BLAST分析显示基因TP63transcript variant4已成功克隆至pLVX-IRES-ZsGreenl载体中,与NCBI上已知序列进行BLAST100%一致。以上结果说明重组体pLVX-IRES-ZsGreenl+TP63transcript variant4已构建成功,可用于后续实验。5.慢病毒包装及病毒滴定测定重组慢病毒转染293T细胞后48h后,荧光显微镜下观察到绿色荧光,表明转染成功。使用上文所述方法测得TP63过表达基因慢病毒滴度为：3.7×108TU/ml TU/ml。6.重组慢病毒感染后ANp63a的表达成功构建pLVX-IRES-ZsGreen1+△NP63α重组慢病毒后,感染C33A, SiHa细胞,单克隆筛选获得稳定表达△Np63a细胞株；采用qRT-PCR方法检测慢病毒感染效果,结果显示：感染重组慢病毒后,C33A、SiHa细胞p63mRNA明显升高。7. ANp63a抑制细胞侵袭、迁移能力采用Trans we11和细胞划痕实验对感染重组慢病毒后的C33A、SiHa细胞系进行侵袭及迁徙能力检测。宫颈癌C33A、SiHa细胞感染重组慢病毒后,其侵袭及迁移能力下降。8.△Np63a抑制EMT显微镜下观察病毒感染后细胞形态的改变发现：过表达ANp63a后SiHa细胞形态由感染前的纺锤形向椭圆形转变,而过表达ANp63a后C33A细胞形态无明显改变,仍为椭圆形。qRT-PCR结果显示,重组慢病毒感染后过表达ANp63a的SiHa、C33A细胞Vimentin mRNA的表达量明显下降,SiHa细胞的β-catenin mRNA的表达升高,而C33A细胞β-catenin mRNA表达量轻微上升。同样Western bloting结果显示,过表达ANp63a的SiHa, C33A细胞Vimentin的蛋白表达量明显下降,β-catenin蛋白表达量上升,C33A细胞则无明显改变。qRT-PCR结果显示,病毒感染过表达ANp63a的SiHa、C33A细胞SNAI2(Slug)明显下降,ZEB1稍下降而ZEB2无明显变化；Western bloting结果显示,过表达ANp63a的SiHa, C33A细胞Slug的蛋白表达量明显下降,ZEB1轻度下降。9. ANp63a以miRNA-205为作用靶点抑制宫颈癌细胞EMTqRT-PCR结果发现,过表达ANp63a的SiHa、C33A细胞miRNA-205明显升高。为进一步验证实验结果,对C33A、SiHa细胞瞬时转染miRNA-205minic,转染miRNA-205minic后C33A、SiHa细胞Vimentin、SNAI2、ZEB1明显下降,而β-catenin无明显改变,这一结果与稳定高表达ANp63a的SiHa、C33A细胞相似,进一步对稳定高表达△Np63a的SHa、C33A细胞进行瞬时转染miRNA-205antagomir,抑制miRNA-205后发现,Vimentin、SNAI2的mRNA表达相对升高,而ZEB1mRNA显著升高,而β-catenin在SiHa细胞表达相对降低而在C33A细胞中无明显改变,以上实验结果提示△Np63a可能以miRNA-205为作用靶点发挥其抑制C33A, SiHa细胞宫颈癌细胞EMT作用。结论1、在宫颈癌细胞及宫颈鳞癌组织中△Np63α是p63α的主要亚型,且在癌中表达降低；2、成功构建△Np63α重组慢病毒；3、ANp63α抑制宫颈癌细胞EMT；4、ANp63α能够以miRNA-205为靶点抑制宫颈癌细胞EMT。