研究背景肝纤维化(liver fibrosis)是指肝脏内弥漫性细胞外基质(extracellular matrix,ECM)(特别是胶原)过度沉积。它不是一个独立的疾病,而是许多慢性肝病的共同病理过程,几乎各种慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化。众多研究表明,组织局部肾素-血管紧张素系统(RAS)与肝纤维化密切相关。在肝纤维化组织中,RAS的组成成分显著上调。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中的一种主要生物活性成分,可刺激肝星状细胞增殖和胶原纤维的合成,因此AngⅡ是促肝纤维化的重要物质。近年来,RAS中新发现的重要组分：血管紧张素转换酶2(ACE2),血管紧张素1-7(Ang-(1-7))引起人们的关注。研究表明Ang-(1-7)通过其受体Mas对AngⅡ发挥负性调控作用,因此Ang-(1-7)能够抑制AngII的促纤维化作用,但是具体机制尚不清楚。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝纤维化发生过程的中的关键细胞。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时,HSC被激活,其表型由静止型转变为激活型,一方面通过大量增殖分化和分泌过量的细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建,另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。氧化应激((xidative stress, OS),是指机体或细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies, ROS)过度产生和/或抗氧化防御功能减弱,引起两者之间平衡严重破坏,造成组织、细胞损伤的一种状态。诸多肝损伤因素在其致病过程中均不同程度地伴有氧化应激,研究已经证明氧化应激在肝纤维化的过程中起到重要的调控作用,其中NADPH氧化酶是损伤肝脏中ROS的一个主要来源。研究已经表明肝星状细胞上存在NADPH氧化酶。对于NADPH氧化酶亚基(NOX1-5和Duoxl and-2),有研究表明NOX1和NOX2在肝星状细胞激活和肝纤维化的发生过程中起到重要作用,但是关于NOX4在肝纤维化中作用的研究尚少。近些年来,有研究表明抗氧化物质能够改善肝纤维化,而Nrf2/ARE通路是细胞内最重要的抗氧化调节系统。Nrf2/ARE通路激活后,下游的抗氧化物质清除氧化应激过程中过多的ROS,从而对抗ROS对细胞的损害。然而,在肝纤维化过程中,关于RAS(AngII和Ang-(1-7))如何调控氧化与抗氧化平衡的机制尚不明确。目的本课题拟通过胆总管结扎的方法构建大鼠肝纤维化模型,予Ang-(1-7)持续腹腔泵入治疗,通过检测氧化还原状态,探讨Ang-(1-7)对大鼠肝纤维化的总体作用以及组织中氧化还原的影响。通过进一步研究AngⅡ和Ang-(1-7)对HSC细胞中氧化与抗氧化平衡的影响明确肝纤维化的可能机制,从而为肝纤维化的发病机制和有效治疗提供理论依据。方法Wistar大鼠根据不同实验目的进行下述不同的实验：1、Wistar大鼠分为假手术组(Sham组)、胆管结扎组(BDL组)以及BDL+Ang(1-7)组,4周后取肝组织,通过HE染色评价肝组织纤维化评分；masson染色计算胶原面积；羟脯氨酸测定、COLIA免疫组化和α-SMA免疫组化测定胶原含量,同时通过荧光定量PCR检测各组COLIA和α-SMA基因表达量的变化。通过免疫印迹(Western blot)和免疫组化染色检测p-smad3和CTGF的表达。2、Wistar大鼠分为假手术组(Sham组)、胆管结扎组(BDL组)以及BDL+Ang(1-7)组,4周后取肝组织,检测各组组织中过氧化氢(H202)和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量；提取总RNA,通过荧光定量PCR检测各组NOX1、NOX2、NOX4、P22phox、P47phox、P67phox、P40phox、Nrf2、GCLC、GSR、 GCLM和NQO1mRNA的表达情况；提取总蛋白,用免疫印迹(Western blot)检测NOX4、Nrf2、Keap1和GCLC蛋白水平表达情况；免疫组化染色判定NOX4和Nrf2的表达。评价各组肝组织氧化抗氧化状态。常规培养的大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系,根据实验目的不同进行下述不同的实验：3、10-7mol/L AngII分别于不同时间点刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系,通过免疫印记方法(Western blot)检测细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、 NOX4、Nrf2、Keap1、GCLC蛋白表达水平的变化。大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为AngⅡ刺激0小时组、0.5小时组、1小时组、2小时组、6小时组、12小时组、24小时组,实验重复3次。4、不同浓度的AngⅡ分别刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系12小时,通过免疫印记方法(Western blot)检测细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、NOX4、 Nrf2、GCLC蛋白表达水平的变化；通过荧光定量PCR检测到Nrf2、GCLC、 NQO1、GSR, GCLM、HO-1mRNA表达水平的变化,用酶标仪测定细胞中ROS的产量。大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为对照组、109mol/L处理组、10-7mol/L处理组、10-5mol/L处理组、2*10-5mol/L处理组、4*10-5mol/L处理组,实验重复3次。5、10-7mol/L Ang-(1-7)分别于不同时间点刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系,通过免疫印记方法(Western blot)检测细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、NOX4、Nrf2、Keap1、GCLC蛋白表达水平的变化。大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为AngⅡ刺激0小时组、0.5小时组、1小时组、2小时组、6小时组、12小时组、24小时组,实验重复3次。6、不同浓度的Ang-(1-7)分别刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系12小时,通过免疫印记方法((?)Vestern blot)检测细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、 NOX4、Nrf2、GCLC蛋白表达水平的变化；通过荧光定量PCR检测到Nrf2、GCLC、NQO1、GSR、GCLM、HO-1mRNA表达水平的变化,用酶标仪测定细胞中ROS的产量。大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为对照组、10-9mol/L处理组、10-7mol/L处理组、10-5mol/L处理组,实验重复3次。7、大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为对照组、AngⅡ组、Ang(1-7)组、AngII+Ang(1-7)组、AngII+Ang(1-7)+A779组、AngII+伊贝沙坦(Irb)组,通过免疫印记方法(Western blot)检测细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、NOX4、Nrf2、GCLC蛋白表达水平的变化,实验重复3次。8、大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为对照组、AngⅡ组、Ang(1-7)组、AngII+Ang(1-7)组,在不同时间点用酶标仪测定细胞中ROS的产量,时间点分别为Omin、5min、10min、15、min,实验重复3次。9、分别用scramble si、si NOX4转染大鼠肝星状细胞T6细胞系72小时,用免疫印迹方法(Western Blot)法检测细胞中COL1A、α-SMA、Nrf2、GCLC、 p-smad3、smad2/3蛋白表达水平的变化。大鼠肝星状细胞T6细胞系分为对照组、AngII、scr si组、scr si+AngII组、si NOX4组、si NOX4+AngⅡ组,实验重复3次。10、分别用scramble si、si smad3转染大鼠肝星状细胞T6细胞系72小时,用免疫印迹方法(Western Blot)法检测细胞中COL1A、α-SMA、NOX4、p-smad3蛋白表达水平的变化。大鼠肝星状细胞T6细胞系分为对照组、AngⅡ、scr si组、scr si+AngII组、si smad3组、si smad3+AngII组,实验重复3次。11、使用大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系,通过共转含有COL1A报告基因带萤火虫荧光素酶基因的质粒和带有海肾荧光素酶基因的质粒,以萤火虫荧光素酶基因作为报告基因,以海肾荧光素酶基因作为内参基因,通过检测萤火虫荧光素酶活性的相对变化情况来鉴定刺激因素(AngII、Ang-(1-7)和抗氧化剂)对COL1A基因是否有调控作用,实验重复3次。12、通过激光共聚焦检测细胞内线粒体ROS的生成,大鼠肝星状细胞HSC-T6分为对照组、AngⅡ处理组,Ang-(1-7)处理组、AngII+Ang-(1-7)处理组和AngII+TEMPO处理组,实验重复3次。13、用流式细胞仪检测细胞中线粒体ROS的量。大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为AngⅡ浓度梯度组(对照组、109mol/L处理组、10-7处理组mol/L、10-5mol/L)、Ang-(1-7)浓度梯度组(对照组、10-6mol/L处理组、10-7mol/L处理组、10-5mol/L处理组)和NOX4干扰组(scr si组、scr si+AngIⅠ组、si NOX4组、si NOX4+AngII组),实验各重复3次。14、大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为对照组、AngⅡ组、Ang(1-7)组、AngII+Ang(1-7)组、AngII+Ang(1-7)+A779组贝沙坦(Irb)组,用凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)检测细胞smad3与细胞DNA的结合活性,实验重复3次。15、不同浓度的SFN(Nrf2激动剂)分别刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系12小时,通过免疫印记方法(Western blot)检测细胞中COL1A、GCLC蛋白表达水平的变化。大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为对照组、5uM处理组、10uM处理组、20uM处理组,实验重复3次。16、通过免疫印记方法(Western blot)检测细胞中COL1A、GCLC蛋白表达水平的变化。大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系分为对照组、AngⅡ处理组、SFN处理组、AngII+SFN处理组,实验重复3次。结果1、在假手术组(Sham组)、胆管结扎组(BDL组)、以及BDL+Ang(1-7)组中,与Sham组相比,BDL组中肝纤维化评分、胶原面积、羟脯氨酸含量、α-SMA的含量均增高(P<0.05)；与BDL组相比,BDL+Ang(1-7)组中肝纤维化评分、胶原面积、羟脯氨酸含量、α-SMA的含量均降低(P<0.05)。与BDL组相比,BDL+Ang(1-7)组中p-smad3和CTGF的表达量降低(P<0.05)。2、与假手术组(Sham组)相比,BDL组H202含量增高(P<0.05),GSH含量降低(P<0.05),mRNA水平NOX1、NOX2、NOX4、P22phox、P47phox、 P67phox、P40phox、Nrf2增高(P<0.05),mRNA水平GCLC、GSR, GCLM和NQO1mRNA的表达降低(P<0.05),蛋白水平NOX4、Nrf2、Keap1的表达增高(P<0.05),GCLC蛋白水平表达降低(P<0.05)。与BDL组相比,BDL+Ang(1-7)组BDL组H202含量降低(P<0.05),GSH含量增高(P<0.05),mRNA水平NOX4和Nrf2降低(P<0.05),mRNA水平GCLC、GSR、GCLM和NQO1的表达升高(P<0.05),蛋白水平NOX4、NrC、Keapl的表达降低(P<0.05),GCLC蛋白水平表达升高(P<0.05)。3、用10-7mol/L AngII刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系后,通过免疫印迹(Western blot)检测到细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、NOX4、Nrf2、Keap1、GCLC蛋白表达水平随着时间的延长而增高(P<0.05)。4、用不同浓度的AnⅡ分别刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系12小时后,通过免疫印记方法(Western blot)检测到细胞中COL1A、α-SMA、 CTGF、NOX4蛋白表达水平随着浓度的增加而增加(P<0.05),而Nrf2、 GCLC在低浓度(10-9mol/L和10-7mol/L)时表达增加,在高浓度(10-5mol/L、2*10-5mol/L和4*10-5mo1/L)时表达下降(P<0.05)；通过荧光定量PCR检测到Nrf2、GCLC、NQO1、GSR, GCLM, HO-1mRNA表达水平在高浓度时表达降低(P<0.05)。细胞中ROS的产量随着刺激浓度增加而增加(P<0.05)。5、用10-7mol/LAng-(1-7)刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系,通过免疫印记方法(Western blot)检测细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、NOX4、Nrf2、 Keap1、GCLC蛋白表达随着时间的延长而降低(P<0.05)。6、用不同浓度的Ang-(1-7)分别刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系12小时后,通过免疫印记方法(Western blot)检测到细胞中COL1A、α-SMA、 CTGF、NOX4、Nrf2、GCLC蛋白表达随浓度增加而降低(P<0.05)；通过荧光定量PCR检测到Nrf2、GCLC、NQO1、GSR, GCLM, HO-1mRNA表达随浓度增加而升高(P<0.05)；细胞中ROS的产量随浓度增加而降低(P<0.05)。7、通过免疫印记方法(Western blot)检测到Ang-(1-7)抑制了AngⅡ诱导细胞中COL1A、α-SMA、CTGF、NOX4、Nrf2、GCLC蛋白表达水平的表达(P<0.05),Mas能抑制Ang-(1-7)对AngⅡ的抑制效果,Irb能抑制AngⅡ的诱导作用。8、用酶标仪检测到细胞中ROS的产量,AngⅡ刺激后随时间延长而增加(P<0.05),Ang-(1-7)抑制了AngⅡ诱导HSC-T6细胞ROS生成(P<0.05)。9、与scr si+AngⅡ组相比,si NOX4+AngII组COL1A、α-SMA、Nrf2、 GCLC、p-smad3、smad2/3蛋白表达水平降低(P<0.05)。10、与scr si+AngII组相比,si smad3+AngII组COL1A、α-SMA、NOX4、 p-smad3蛋白表达水平降低(P<0.05)。11、萤火虫荧光素酶活性随AngⅡ的浓度增加而增加(P<0.05)。萤火虫荧光素酶活性随Ang-(1-7)的浓度增加而降低(P<0.05)。抗氧化剂(NAC、DPI、 catalase)抑制AngⅡ对HSC-T6细胞萤火虫荧光素酶活性的诱导作用(P<0.05)。12、与对照组相比,激光共聚焦检测到AngⅡ处理组细胞内线粒体ROS的生成增加,AngⅡ+Ang-(1-7)处理组和AngⅡ+TEMPO处理组细胞内线粒体ROS的生成较AngⅡ处理组下降。13、用流式细胞仪检测到细胞中线粒体ROS的含量随AngⅡ浓度梯度增加而增加,随Ang-(1-7)浓度降低而降低。内源性干扰NOX4表达后抑制了AngII对细胞中线粒体ROS的诱导作用。14、通过凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测到Ang-(1-7)抑制AngⅡ诱导的细胞smad3和DNA的结合活性,Mas能抑制Ang-(1-7)对AngⅡ的抑制效果,Irb能抑制AngⅡ的诱导作用。15、通过免疫印记方法(Western blot)检测到细胞中GCLC蛋白表达随SFN浓度增加而升高(P<0.05),COL1A蛋白表达随SFN浓度增加而降低(P<0.05)。16、通过免疫印记方法(Western blot)检测到细胞中AngⅡ+SFN处理组COL1A表达较AngⅡ处理组降低(P<0.05)。AngⅡ+SFN处理组GCLC蛋白表达较SFN处理组低(P<0.05)。结论1、外源性Ang-(1-7)持续腹腔泵入可以改善BDL诱导的大鼠肝纤维化。2、外源性Ang-(1-7)持续腹腔泵入抑制氧化应激,激活了抗氧化系统。3、AngⅡ可以诱导由NOX4介导的氧化应激,激活smad3通路,促进HSC活化以及胶原生成。4、Ang-(1-7)可以抑制AngⅡ诱导的NOX4介导的氧化应激,从而改善肝纤维化。5、低浓度AngⅡ激活Nrf2/ARE通路,高浓度AngⅡ对Nrf2/ARE通路起到抑制作用。