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研究背景与目的： 近年来研究表明在大量肿瘤细胞和肿瘤组织中往往有原癌基因c-met过表达，其表达产物c-Met蛋白与结肠癌的增殖、迁移和侵袭能力也密切相关。而NK4可阻断由c-Met受体介导的信号途径导致的肿瘤细胞增殖，侵袭和转移，将为肿瘤治疗提供一种很好的策略。此外，已知化疗药物大都可以通过诱导肿瘤细胞的凋亡而发挥抗肿瘤效应，肿瘤细胞的凋亡逃逸不但对肿瘤的发生、发展起着重要作用，也是导致肿瘤细胞对化疗药物耐受的重要途径。而c-Met受体活化可抑制肿瘤细胞凋亡。 基于以上分析，我们提出这样一种设想：利用将NK4基因肿瘤转染至肿瘤细胞，可表达NK4通过抑制c-Met受体，除了直接发挥抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，还可促进凋亡，这与化疗药物的促凋亡作用相协同，可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感度。为此，本研究构建含有NK4基因的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-NK4质粒，转染结直肠细胞株HCT116细胞，并与化疗药物奥沙利铂联合应用。观察奥沙利铂联合NK4基因对HCT116细胞增殖、侵袭作用、凋亡的影响。 方法： 1．以原核表达质粒pGEX-4T-1-NK4为模板,CTS712-F/CTS712-R为引物进行PCR扩增。PCR产物及真核细胞表达质粒pcDNA3.1质粒KpnⅠ/BamHⅠ双酶切后电泳，切胶回收。将回收的CTS712V和CTS712I片段连接，热转化至E.coli感受态细胞JM109。涂布平板过夜培养菌体，挑选菌落，提取质粒。将CTS712-1质粒、CTS712-2质粒用KpnⅠ/BamHⅠ进行双酶切，基因测序鉴定质粒构建是否成功。 2.．制作E.coli感受态细胞DH5a，将pcDNA3.1-NK4质粒转化至感受态细胞DH5a中。涂平板，过夜培养菌体，挑选菌落，扩大培养，提取质粒并纯化。 3．将pcDNA3.1-NK4质粒转染至大肠癌HCT116细胞中。提取细胞总RNA，RT-PCR反应进行鉴定。 4．CKK-8法检测NK4基因对HCT116细胞的增殖的影响；Transwell法检测细胞的侵袭能力的改变，AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。 5．奥沙利铂处理HCT116细胞，倒置显微镜下观察奥沙利铂在不同浓度下细胞形态的变化。 6．CCK-8法测定细胞的OD值，分析在不同奥沙利铂药物浓度下对HCT116细胞毒性的影响以及奥沙利铂最低药物浓度与NK4基因对HCT116细胞增值的影响；AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测奥沙利铂/NK4对HCT116细胞凋亡的影响。 7．利用Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验观察奥沙利铂/NK4对HCT116细胞迁移、侵袭能力的影响。 结果： 1．经鉴定CTS712-1质粒即是我们需要的pcDNA3.1-NK4质粒。 2．大肠癌HCT116细胞的NK4基因PCR扩增后，空白组的2-ΔΔCt为100％，pcDNA3.1阴性对照组的2-ΔΔCt为446.40%，pcDNA3.1-NK4处理组的2-ΔΔCt为725313%。CCK-8实验结果表明，HCT116细胞转染重组质粒pcDNA3.1-NK4后，抑制了细胞的增殖；Transwell实验结果转染后侵袭率降为原先的50%左右；流式细胞术检测结果显示细胞凋亡率提高了约12%。 3．大肠癌HCT116细胞在常规培养条件下，细胞延展，呈不规则形状，排列紧密。奥沙利铂溶液处理细胞6小时后，细胞变圆，被膜突起，间隙增大，有细胞碎片出现。当奥沙利铂溶液浓度为12.5μl/ml时，细胞发生凋亡，切随着浓度的增高，凋亡现象越明显。 4．CCK-8实验结果显示，细胞OD值随着奥沙利铂药物浓度的增加而逐渐减小；在奥沙利铂药物浓度为6.3μg/ml时，细胞OD值与对照组相比有一定的下降，但不显著。当药物浓度为12.5μg/ml时，细胞OD值明显小于细胞OD值的OD值，有显著的差异。 5．CCK-8检测奥沙利铂联合NK4基因对HCT116细胞增值的影响，结果显示奥沙利铂/NK4处理组的OD值最小。统计学分析结果显示，奥沙利铂/NK4与阴性对照组、奥沙利铂处理组和空白组比较，差异显著，均具有统计学意义。 6．流式细胞术结果显示，奥沙利铂联合NK4基因作用HCT116细胞后，凋亡率提高一倍。 7．奥沙利铂联合NK4基因作用下，细胞HCT116的迁移和侵袭能力分别降为89.3%，58.7%。 结论： 1．本研究成功构建了重组质粒pcDNA3.1-NK4质粒，并可在大肠杆菌DH5a中进行NK4的扩增与克隆。 2．将重组质粒pcDNA3.1-NK4基因转染结直肠癌细胞株HCT116细胞后，细胞的生长受到抑制，细胞的侵袭能力降低；NK4基因可以抑制HCT116细胞的增殖、侵袭、促进细胞凋亡。 3．奥沙利铂联合NK4基因作用HCT116细胞后，能够促进细胞凋亡；抑制细胞的增殖，也抑制其侵袭迁移能力。 4．NK4基因转移除直接发挥抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，还可促进凋亡，这与奥沙利铂的促凋亡作用相协同，增加了肿瘤细胞对化疗药物的敏感度。