论文部分内容阅读
异戊二烯是一种重要化工平台化合物，主要用作合成橡胶的单体。目前，异戊二烯主要通过石油裂解精馏获取。随着化石资源的逐渐枯竭，研究者们开始寻找新的生产异戊二烯的方法。利用微生物转化可再生的生物质资源合成异戊二烯具有可持续性，环境友好性等特点，近年来受到越来越广泛的关注。生物法合成类异戊二烯化合物的共同前体物质为二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)和异戊二烯焦磷酸(IPP)，其中，DMAPP能够在异戊二烯合成酶(IspS)的催化作用下生成异戊二烯，而IPP和DMAPP可以在异戊二烯焦磷酸异构酶的作用下相互转化，因此我们推测异戊二烯焦磷酸异构酶的异源表达有助于生物法合成异戊二烯产量的提高。本研究分别克隆了来自大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因(idi)和来自枯草芽孢杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因(fni)，构建到原核表达载体上，并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源过量表达。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了二者均以可溶性的形式表达，通过酶活测定验证了二者的催化功能。然后将这两个不同来源的异戊二烯焦磷酸异构酶分别导入到能够合成β-胡萝卜素和异戊二烯的工程菌株中，比较了它们对于这两种类异戊二烯化合物产量的影响。结果表明，来自枯草芽孢杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶具有更高的活性，对β-胡萝卜素和异戊二烯的产量有明显的促进作用，该酶的异源表达使β-胡萝卜素的含量由1.08mg/L提高到3.25mg/L，异戊二烯的产量由0.80mg/L提高到2.96mg/L；而表达来自大肠杆菌异戊二烯焦磷酸异构酶的工程菌株，其β-胡萝卜素和异戊二烯的产量仅达到1.98mg/L和0.95mg/L。本研究通过改造类异戊二烯合成途径中的关键步骤，增强整个途径的代谢能力，大大提高了β-胡萝卜素和异戊二烯的产量和产率，为此类产品的微生物发酵生产打下基础。