【摘 要】
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由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染引起的,以妊娠母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状和高死亡率为主要特征的猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,是对全球养猪业危害极大的猪重要病毒性传染病。由于
【基金项目】
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陕西省农业科技创新转化项目（NYKJ-2016-08）； 国家自然科学基金项目（No.31472173）；
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由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染引起的,以妊娠母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状和高死亡率为主要特征的猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,是对全球养猪业危害极大的猪重要病毒性传染病。由于PRRSV具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用和持续性感染等特征,再加上我们仍未完全清楚PRRSV的生物学特性及其感染和致病机制,至今仍无确实有效的防制措施。microRNA（miRNA）作为基因表达的关键调控因子在PRRSV与宿主细胞的相互作用网络中发挥极其重要的调控作用。我们课题组前期进行的小RNA高通量测序研究发现高致病性和低致病性的PRRSV感染均可诱导宿主靶细胞-猪肺泡巨噬细胞（PAMs）编码的miRNAs表达水平的改变,其中miR-10a和miR-10b在PRRSV感染后显著上调表达,提示其在PRRSV感染过程中发挥重要作用。但miR-10a和miR-10b在PRRSV感染过程中的作用及其发挥作用的分子机制尚不清楚。因此,本论文拟进一步验证PRRSV感染对细胞miR-10a和miR-10b表达的影响,阐明miR-10a和miR-10b在PRRSV感染细胞过程中的作用及其分子机制。主要研究内容和结果如下:1.PRRSV感染诱导PAMs中miR-10a-5p和miR-10b上调表达分别用1 MOI的高致病性HP-PRRSV GD-HD毒株和经典N-PRRSV CH-1a毒株感染宿主靶细胞PAMs,然后应用qRT-PCR方法检测感染后不同时间点细胞中miR-10a-5p和miR-10b的表达水平。结果显示,HP-PRRSV和N-PRRSV感染均诱导了PAMs中miR-10a-5p和miR-10b上调表达,表明PRRSV感染确实影响宿主细胞中miR-10a-5p和miR-10b的表达。2.miR-10a-5p和miR-10b抑制PRRSV在PAMs中的复制人工合成miR-10a-5p和miR-10b的mimics,分别于不同毒力的PRRSVs感染前或感染后转染mimics使miR-10a-5p和miR-10b过表达,以明确其对PRRSV复制的影响。结果表明,无论在PRRSV感染前还是在PRRSV感染后过表达miR-10a-5p和miR-10b均可显著抑制HP-PRRSV和N-PRRSV在PAMs中的复制。这些结果表明PRRSV可能利用miR-10a-5p和miR-10b负调控病毒的感染与复制以建立持续感染。3.miR-10a-5p通过抑制翻译的方式降低靶基因SRP14的表达通过生物信息学预测、双荧光素酶报告系统、定点突变、qRT-PCR和Western blot等研究,证明了miR-10a-5p能够特异性结合到其靶基因猪信号识别颗粒SRP14 mRNA的3’UTR区,通过翻译抑制而非mRNA降解的方式降低了SRP14的表达水平。4.SRP14促进PRRSV感染通过腺病毒介导的特异性过表达SRP14,能够促进高致病性PRRSV和经典PRRSV感染;应用siRNA介导的RNAi降低PAMs中SRP14的基础表达水平,能够显著抑制高致病性PRRSV和经典PRRSV在PAMs中的复制。这些结果表明SRP14能够促进不同毒力的PRRSVs感染。综上所述,本研究从病毒与宿主细胞相互作用的角度,明确了PRRSV感染对宿主靶细胞中miRNAs miR-10a-5p和miR-10b表达的影响,阐明了宿主miR-10a-5p和miR-10b对PRRSV感染的调控作用,并探索了宿主miR-10a-5p调控PRRSV感染的分子机制。该研究结果不仅有助于更好的理解miRNA介导的PRRSV-宿主细胞的互作机制,也为筛选与PRRS抗性或易感性相关的基因奠定前期基础。
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