c-Met又称肝细胞生长因子（HGF）受体,属于受体酪氨酸激酶家族（RTKs）。HGF与c-Met结合可以调控下游的多种信号通路参与多种生理过程,包括细胞的增殖和存活、细胞凋亡和血管生成等,HGF/c-Met信号通路发生异常会导致肿瘤的发生发展。特别的,c-Met信号通路的过表达与临床上较差的愈后和EGFR抑制剂的耐药密切相关。克唑替尼（Crizotinib）和卡博替尼（Cabozantinib）是目前已经上市的两个c-Met小分子抑制剂,在肿瘤的临床治疗上效果显著,但随之产生的获得性耐药大大降低了c-Met靶向药物的抗肿瘤疗效和应用价值。目前临床上报道的c-Met的耐药机制主要有基因的扩增和过表达、c-Met突变以及旁通路激活等。因此,针对不同的耐药机制引入新的手段和新的技术有效逆转c-Met抑制剂的获得性耐药,是临床分子靶向肿瘤治疗的迫切需求。本论文的研究内容主要由两部分组成:第一部分是针对由c-Met基因的扩增和过表达以及点突变导致的耐药,采用PROTAC策略设计研发c-Met靶向降解剂;第二部分是针对由c-Met的旁通路激活如c-Myc的上调产生的耐药,探索c-Met/BRD4双重抑制剂的设计和发现。PROTAC是一种基于细胞自身的泛素蛋白酶体系统降解蛋白的机制发展而来的新型靶向降解目标蛋白的技术。PROTAC分子是一种双功能分子,既能与目标蛋白结合,又能招募E3泛素连接酶,从而将目标蛋白泛素化,进而通过蛋白酶体将目标蛋白降解。相较于传统小分子抑制剂的作用,PROTAC分子能够降解整个目标蛋白,因此PROTAC分子有望克服由于靶蛋白突变产生的获得性耐药问题。基于这一策略,我们从课题组前期研发的c-Met小分子抑制剂LXM-262出发,通过优化连接链（长度、极性、连接方式）和E3泛素连接酶底物（CRBN,VHL两种E3泛素连接酶的配体）,共合成37个c-Met靶向的PROTAC双功能分子,在酶活性、细胞活性测试中都显示出强效的抑制作用。其中使用VHL的配体以及聚乙二醇连接链得到的先导化合物2-28,不但具有强效的c-Met激酶抑制活性和c-Met依赖肿瘤细胞增殖抑制活性（c-Met IC50=129 nM;EBC-1 IC50=0.36 μM）,而且在细胞实验中展示有效的 c-Met蛋白降解活性（DC50=10 nM）。更重要的是,对c-Met抑制剂获得性耐药肿瘤细胞株 EBC-1/D228Y,c-Met 靶向的 PROTAC 分子 2-28（EBC-1/D228Y IC50=0.24 μM）相比于LXM-262（EBC-1/D228Y IC50=0.7 μM）表现出了显著的疗效优势。一系列机理验证实验表明化合物2-28确实是一个有效的降解剂,并且降解c-Met是通过泛素蛋白酶体途径实现的。进一步的药代动力学评价表明,化合物2-28在静脉注射给药后被迅速代谢,半衰期仅为0.1小时。PROTAC分子由于分子量大,在理化性质和药代动力学方面性能不理想,所以,为了得到具有成药性的小分子降解剂,我们又采用“分子胶水”策略,来发现c-Met靶向的新型降解剂。通过c-Met抑制剂和CRBN结合配体的活性骨架杂合的策略,我们设计得到了一系列双靶标化合物。其中化合物2-37（c-Met IC50=3 nM,EBC-1 IC50=0.13 μM）细胞活性显著提升,同时在耐药细胞株中化合物2-37的活性（IC50=0.17μM）仍然优于 LXM-262（IC50=0.64 μM）近 4 倍。但在细胞实验的 western blotting检测中,化合物2-37并不能明显降解c-Met蛋白。我们认为其活性的提升有两种可能,一种可能是2-37酶活抑制活性的提高使其仅发挥了 c-Met抑制剂的作用。另一种可能是2-37仍然是一个降解剂,可能降解了 c-Met信号通路相关的其他关键蛋白,从而抑制了其功能。目前我们正在采用蛋白组学实验研究其作用机制。本论文的第二部分研究内容主要针对由c-Met的旁通路激活产生的耐药,设计c-Met/BRD4双重抑制剂的尝试。已有研究表明,c-Myc的上调是c-Met获得性耐药的原因之一,而下调c-Myc可以逆转c-Met的获得性耐药问题。BRD4介导c-Myc的转录,其抑制剂可以有效下调c-Myc的表达。因此,c-Met小分子抑制剂与BRD4抑制剂合用,在克服c-Met的获得性耐药方面具有一定的协同作用。考虑到药物联用中面临的药物-药物相互作用等潜在问题,我们预期c-Met/BRD4小分子双重抑制剂可解决c-Myc上调导致的c-Met的获得性耐药问题。经过初步的探索,我们使用骨架跃迁以及杂合等策略设计并合成了哒嗪并三氮唑类化合物29个,这些化合物都表现出了较好BRD4活性,其中化合物3-26（BRD4 IC50=98 nM）活性仅与阳相对照JQ1相差一倍,但对于c-Met缺乏有效抑制。后续的工作主要围绕提高c-Met的活性展开。总之,我们针对c-Met小分子抑制剂在临床的获得性耐药问题,根据两种主要的耐药机制,分别采用PROTAC策略和c-Met/BRD4双重抑制策略进行了一系列新型靶向抗肿瘤药物的设计合成及其活性研究,获得了一些积极结果。特别是在运用PROTAC策略得到有效降解c-Met耐药突变的降解剂,为进一步成药性优化发展成为有临床应用前景的新型抗肿瘤药物提供了先导化合物和新的作用机制。