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第一部分:GBP3在胶质瘤中的表达及对患者预后、替莫唑胺化疗敏感性调控的研究目的:鸟苷酸结合蛋白（Guanylate binding proteins,GBPs）家族多个成员在胶质瘤中表达增高,并可促进胶质瘤恶性生物学行为。本部分研究拟阐明GBP3在胶质瘤中的表达情况、与O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）及患者预后的相关性,并探索DNA损伤后GBP3表达的变化及GBP3对替莫唑胺（temozolomide,TMZ）敏感性的影响,为GBP3成为胶质瘤临床治疗的潜在靶点提供理论依据。方法:通过分析数据库（TCGA和CGGA数据库）中GBP3表达差异及与胶质瘤患者预后的关系,比较MGMT启动子甲基化组和未甲基化组中GBP3的表达差异;通过蛋白免疫印迹法（Western blot）和免疫组化染色法检测正常脑组织、瘤旁和胶质瘤组织中GBP3的表达差异及其与MGMT蛋白表达的相关性;以TMZ（不同浓度或不同时间长度）处理胶质瘤细胞,通过荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）、Western blot检测GBP3的mRNA及蛋白表达变化;通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术和Western blot法探究敲低和过表达GBP3对TMZ处理后的胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响;通过Western blot和免疫荧光检测GBP3对ATM-γ-H2AX通路的影响;通过彗星实验检测GBP3对TMZ诱导DNA损伤的影响。结果:GBP3在胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）中表达高于低级别胶质瘤（low grade glioma,LGG）,后者又高于正常或瘤旁组织,其表达的高低与患者的预后呈负相关;通过对TCGA数据库的分析提示GBP3的mRNA表达在MGMT启动子未甲基化组显著高于甲基化组,Western blot结果显示胶质瘤组织中GBP3和MGMT蛋白的表达呈高度正相关;TMZ处理胶质瘤细胞后可诱导 GBP3的mRNA和蛋白表达上调,电离辐射处理胶质瘤细胞可诱导GBP3蛋白表达上调:敲低GBP3表达可抑制TMZ处理后的胶质瘤细胞增殖和克隆形成能力,并增加其凋亡和DNA损伤水平,而过表达GBP3可增加TMZ处理后的胶质瘤细胞增殖和克隆形成,并抑制其凋亡和DNA损伤水平。结论:1.GBP3在胶质瘤组织中表达上调,与患者预后呈负相关,与MGMT的蛋白表达呈正相关。2.DNA损伤可诱导GBP3表达上调,敲低GBP3增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,过表达则降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。第二部分STING在胶质瘤中的作用及GBP3对其调控的分子机制目的:DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是肿瘤耐药中十分重要的应激过程。干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes,STING）作为DNA传感器,在感应DNA后可以诱导干扰素（interferon,IFN）和炎症细胞因子抵御微生物感染,但其在肿瘤发生中的作用尚不明确。本部分研究拟阐明STING在胶质瘤中的表达、对患者预后及胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响,并探索STING在调控TMZ敏感性中的作用及GBP3对STING调控的分子机制。方法:通过CGGA和TCGA数据库分析STING在胶质瘤中的表达及其与患者预后的关系;通过CCK-8、Transwell实验、裸鼠皮下荷瘤实验验证STING对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响;通过Western blot法分析胶质瘤组织中GBP3和STING蛋白表达的相关性;分别敲低GBP3和STING表达后,通过qPCR和Western blot检测对相互mRNA和蛋白表达的影响;通过免疫荧光法检测GBP3和STING在胶质瘤细胞中的定位;使用MG-132（蛋白酶体抑制剂）抑制蛋白的泛素化降解后,通过Western blot验证GBP3对STING蛋白稳定性的影响;利用GBP3（全长和截断突变体质粒）和STING过表达质粒在293T细胞中共转染,通过免疫共沉淀实验检测两者蛋白的相互作用;通过Western blot检测TMZ处理对STING蛋白表达的影响;通过Western blot检测敲低和过表达STING对PARP蛋白表达的影响;通过Western blot和流式细胞术检测在敲低GBP3的细胞中过表达STING对TMZ敏感性的回复作用。结果:STING在胶质瘤组织中高表达,与患者预后呈负相关,与GBP3的mRNA及蛋白表达呈正相关;敲低STING可抑制体外胶质瘤细胞增殖、侵袭,可抑制SNB19细胞成瘤率和GBM12细胞体内生长速度;敲低GBP3或STING可抑制相互蛋白的表达,但不影响对方mRNA的表达;敲低GBP3可同时抑制内源性和外源性STING的蛋白表达,后续过表达GBP3后STING的蛋白表达可以得到恢复;GBP3和STING在胶质瘤细胞中存在大量共定位,GBP3通过与STING发生蛋白相互作用调控其蛋白稳定性,GBP3通过N端结构域与STING结合;TMZ可诱导STING的蛋白表达上调,敲低STING可增加TMZ诱导的凋亡,过表达STING可部分回复敲低GBP3增加的TMZ敏感性。结论:1.STING在胶质瘤中高表达,与患者预后负相关,与GBP3的表达正相关。2.敲低STING可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和皮下成瘤。3.TMZ诱导STING蛋白表达上调,并可降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。4.GBP3通过和STING蛋白相互作用调控其稳定性,过表达STING可回复敲低GBP3增加的TMZ敏感性。第三部分GBP3-STING介导p62-NRF2信号及MGMT表达调控的初步探索目的:NRF2在多种肿瘤耐药中发挥重要功能,包括在胶质瘤中参与对TMZ敏感性的调控。p62-NRF2信号对胶质瘤的侵袭及间充质转化具有重要作用。本部分研究拟阐明GBP3和STING与p62-NRF2信号的调控关系及机制,探索p62-NRF2信号在GBP3调控TMZ敏感性中的作用,并研究GBP3-STING-NRF2轴对MGMT的调控作用。方法:通过数据库分析胶质瘤中p62、NRF2的mRNA表达及其与GBP3、STING的相关性、与胶质瘤患者预后的关系;通过免疫组织化学法检测GBP3、STING和NRF2在胶质瘤组织中的表达;通过qPCR、Western blot和免疫荧光法验证在胶质瘤细胞中敲低GBP3、STING表达对p62-NRF2通路的调控作用;通过Western blot检测TMZ处理胶质瘤细胞对p62、NRF2和MGMT蛋白表达的影响;通过流式细胞术和Western blot检测敲低p62对TMZ敏感性的影响;通过流式细胞术和Western blot检测在野生型或敲低GBP3的细胞中过表达NRF2对TMZ敏感性的影响;通过qPCR法检测过表达NRF2对GBP3 mRNA表达的影响;通过Western blot检测敲低GBP3、STING的表达、过表达NRF2及ML385（NRF2特异性抑制剂）抑制NRF2表达对MGMT蛋白表达的影响;通过Western blot和流式细胞术检测过表达GBP3及其突变体对TMZ敏感性的影响;通过裸鼠皮下及颅内荷瘤实验在体内验证敲低GBP3对肿瘤生长速度及TMZ敏感性的影响。结果:CGGA数据库分析结果显示p62、NRF2的mRNA表达与GBP3、STING呈正相关、与胶质瘤患者的预后呈负相关;免疫组化结果显示NRF2和GBP3-STING的表达正相关,在GBM中均高表达;敲低GBP3或STING的表达可抑制p62-NRF2通路mRNA和蛋白的表达,其中NRF2胞质和胞核蛋白表达均下降;TMZ长时间（＞24h）处理胶质瘤细胞后可抑制p62、NRF2和MGMT蛋白表达;敲低p62可增加TMZ诱导的细胞凋亡比例及凋亡蛋白Cleaved-PARP的表达;过表达NRF2可增加GBP3的mRNA和蛋白表达,过表达NRF2可降低TMZ敏感性并部分回复敲低GBP3增加的TMZ敏感性;敲低GBP3、STING的表达及ML385抑制NRF2的表达均可降低MGMT蛋白的表达,过表达NRF2则增加MGMT的蛋白表达;GBP3全长蛋白及其1-280AA截断突变体可降低TMZ诱导的凋亡,而D182N点突变及282-595AA截断突变蛋白不具有GBP3降低TMZ敏感性的功能;敲低GBP3可抑制GSC62细胞体内生长速度并提高TMZ的敏感性。结论:1.p62和NRF2的mRNA表达分别与GBP3、STING的表达呈正相关、与患者的预后呈负相关。2.GBP3-STING能促进p62-NRF2通路信号转导,p62-NRF2通路可降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。3.抑制GBP3-STING-NRF2轴可降低MGMT蛋白表达,NRF2可上调GBP3和MGMT的表达并部分回复敲低GBP3增加的TMZ敏感性。4.GBP3 N端结构域蛋白可降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。5.敲低GBP3可提高TMZ体内敏感性。