目的三氧化二砷(ATO),是砒霜的重要组成成分,在中国已经被使用了两千多年。20世纪70年代ATO被我国学者首先用于治疗复发性和难治性急性早幼粒细胞性白血病(APL)。ATO是一个经典的细胞凋亡诱导剂,虽然在在急性早幼粒细胞白血病治疗中疗效显著,但ATO在淋巴瘤中的治疗作用仍然是有限的,这可能与淋巴瘤不恰当的信号通路的激活及凋亡耐受有关,如信号转导和转录因子3(STAT3)及抗凋亡蛋白Bcl-2高表达等。以前的研究表明葫芦素B(Cucurbitacin B,Cu B)是一种有效的STAT3抑制剂,在多种肿瘤中展现出强大的抗肿瘤效应。Huang等研究显示STAT3的激活与弥漫大B淋巴瘤的预后不良密切相关。因此我们猜想,葫芦素可以通过抑制STAT3磷酸化增强ATO在淋巴瘤中的作用,改善淋巴瘤的凋亡耐受。ATO和Cu B的合用在淋巴瘤中至今还未被尝试过。结合相关研究背景和现状,我们决定探索中药栝楼对淋巴瘤细胞的作用,并探索其有效成分是否为Cu B,同时探索Cu B是否可以在体内外协同增强ATO的抗淋巴瘤作用。最后进一步研究Cu B联合ATO抑制淋巴瘤的作用机制是否为Cu B抑制了STAT3磷酸化。材料与方法1.栝楼粗提物(TKE)对Burkitt’s淋巴瘤Ramos细胞增殖,凋亡和周期的影响:培养Burkitt淋巴瘤细胞株Ramos细胞和乳腺癌细胞MCF-7细胞,分别加入不同浓度梯度的TKE培养48h,台盼蓝拒染实验观察不同浓度的TKE对两种细胞增殖的影响;设置不同浓度的TKE剂量组(2.5ug/ml TKE,5ug/ml TKE和空白对照组),FCM检测Ramos细胞在0h,12h,24h的凋亡情况;FCM检测Ramos细胞周期阻滞情况。2.使用高效液相色谱指纹图谱技术(HPLC)证实Cu B是否为栝楼的有效成分。3.Cu B对Ramos细胞增殖及凋亡,周期的影响:培养Ramos细胞,加入不同浓度的Cu B,台盼蓝拒染实验观察细胞增殖;FCM检测48h后的细胞凋亡率和周期分布。4.Cu B和ATO合用对淋巴瘤细胞增殖的影响:传代培养Ramos、G519两种淋巴瘤细胞。设不同浓度药物Cu B(1,2.5,5 nmol/L)和ATO(0.5,1,2μmol/L)单用及合用组剂量组,共培养24小时,MTS法检测Cu B联合ATO对两种细胞增殖的影响。5.Cu B和ATO合用对淋巴瘤细胞凋亡的影响:传代培养Ramos、G519两种淋巴瘤细胞。每种细胞加入1 umol/L ATO和5 nmol/L Cu B。FCM法检测Ramos、G519两种细胞的凋亡情况,Western blot检测细胞凋亡蛋白酶caspase8,9,3的变化。6.Cu B和ATO合用的抗肿瘤作用机制的研究:通过Western blot检测了经Cu B和ATO单独及联合处理后,Ramos细胞内一些信号通路蛋白P-STAT3、P-Erk1/2、bcl-2、Bax表达水平的变化。7.Cu B和ATO合用的体内抗肿瘤作用研究:以Ramos细胞注入裸鼠体内建立淋巴瘤裸鼠移植瘤模型。设空白对照组,Cu B单药组,ATO单药组,Cu B与ATO合用组,给药20天后处死小鼠,计算抑瘤率。免疫组化检测PCNA,STAT3的表达情况;TUNEL法检测淋巴瘤细胞原位凋亡情况。结果1.栝楼粗提物(TKE)对Burkitt’s淋巴瘤Ramos细胞增殖,凋亡,周期的影响TKE能以时间与剂量依赖性的方式抑制Ramos细胞增殖;TKE明显诱导Ramos细胞凋亡,在2.5μg/m L或5μg/m L TKE处理24 h后,TKE能以时间和剂量依赖性的方式诱导Ramos细胞凋亡;在24 h时,2.5和5μg/m L TKE组Ramos细胞的凋亡率的分别为33.93(±8.52)%,和71.33(±16.49)%(P<0.05)。通过凋亡检测散点图可以观察到,在12 h和24 h之间,细胞呈现出一个明显从早期凋亡到晚期凋亡的动态过渡。细胞周期结果显示,TKE能诱导Ramos细胞组滞在G1期。2.Cu B:栝楼是活性成分之一通过分析,TKE在310 nm紫外线的保留时间是30.478s。高效液相色谱指纹图谱显示的Cu B在310 nm的保留时间为30.395分钟。因为保留时间的范围的偏差在±2.5%,所以它可以证实,Cu B是栝楼活性成分之一。3.Cu B对Burkitt淋巴瘤Ramos细胞增殖,凋亡,周期的影响台盼蓝染色细胞计数结果显示,2.5 nmol/L和5 nmol/L Cu B能呈时间和浓度依赖性地方式抑制Ramos细胞增殖。细胞凋亡检测的结果显示Cu B对Ramos细胞有明显的凋亡诱导作用。Ramos细胞的凋亡率在10 nmol/L Cu B处理后24h高达64.4(±13.4)%(P<0.05)。细胞凋亡散点图显示24 h时,大量的细胞进入细胞晚期凋亡。在细胞周期检测中,Ramos细胞经10 nmol/L Cu B处理后显示出S期阻滞。4.Cu B与ATO联合应用的体外抗淋巴瘤作用4.1药物联合实验果表明,低剂量的Cu B与ATO联合使用时,Cu B能以协同地方式大大增强了ATO对Ramos细胞的增殖抑制作用,但没有提高ATO对G519细胞的影响。4.2细胞凋亡检测显示,联合治疗组(ATO+Cu B)的细胞凋亡率高于Cu B或ATO单独作用。在G519细胞中,无明显协同作用。Western blot结果显示凋亡蛋白酶caspase8,9,3有明显的裂解,表明Cu B和ATO可同时通过内源性和外源性凋亡通路诱导细胞凋亡。4.3在联合作用机制上,Western blot显示,经Cu B和ATO联合处理后Ramos细胞内P-STAT3和P-Erk1/2水平下降,总STAT3和Erk没有显著改变。进一步检测STAT3和Erk的下游靶标水平,发现抗凋亡蛋白bcl-2表达下调,促凋亡蛋白Bax上调。5.Cu B和ATO合用的体内抗肿瘤作用为了进一步证实葫芦素与ATO合用的抗淋巴瘤作用,Ramos淋巴瘤移植瘤模型被建立。设立生理盐水(NS)组,Cu B单药组,ATO单药作用,Cu B与ATO合用药组。经过20天腹腔给药,结果显示,Cu B与ATO合用组瘤块平均体积减小,小于对照组和Cu B和ATO单用组。每组的平均瘤重为1.34±0.47g,1.20±0.69g,0.73±0.57g,0.25±0.22g,合用组抑瘤率达到85.6%。结论:1.Cu B是栝楼的活性成分之一。2.Cu B在Burkitt’s淋巴瘤中具有强大抗淋巴瘤作用。3.Cu B在体内和体外实验中均显示出能协同增强ATO的抗淋巴瘤作用。4.Cu B是通过抑制STAT3磷酸化来协同增强ATO的抗淋巴瘤作用。5.Cu B可以成为未来淋巴瘤治疗中的一种联合用药的理想选择。