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目的:脑卒中不仅会造成急性期脑损伤,由于损伤脑组织恢复不佳,也会引起恢复期运动功能的损伤,造成极高的致残率。由于rt-PA过窄的时间窗限制,在脑卒中发生后的24小时内患者常常不能得到及时治疗,因此开始于脑卒中发生24小时之后的延迟治疗越来越受到人们的重视与关注。丹参作为一种中药,已被各种研究证实具备神经保护作用,并广泛应用于缺血性脑卒中患者。注射用丹参多酚酸是从丹参中提取的复方成分,已有实验证实其在脑卒中的急性期具有神经保护作用,但对于这种药物对脑卒中延迟治疗效果及其是否可改善脑卒中后神经功能的恢复及可能的作用机制却研究甚少。成年哺乳动物脑内存在两个能产生大量神经元的生发区,分别为侧脑室的脑室下带(subventricular zone,SVZ)和海马的颗粒下带(subgranular zone,SGZ)。在一些刺激如缺血性脑卒中的作用下,SVZ区神经前体细胞能被激活而增殖并向缺血半暗带迁移,分化成熟以取代梗死区受损的神经元,以促进神经功能恢复。Sonic hedgehog(Shh)信号通路在神经系统和多种器官的正常形成和构建中起重要作用,近年来该信号因与神经组织发生及神经前体细胞的增殖、分化、迁移的密切关系而备受关注。一些神经生长因子可促进成年动物脑内神经再生,在缺血性脑卒中的恢复期与运动功能的恢复密切相关。Brain derived neurotrophic factor(BDNF)和Nerve Growth Facto(NGF)已证实在生理和病理条件下均与脑内SVZ区神经前体细胞的增殖、分化及迁移紧密相关。但是,对于Shh信号通路与BDNF及NGF表达的关系仍知之甚少。本实验旨在研究注射用丹参多酚酸的延迟性治疗可否促进缺血性脑卒中后恢复期神经功能的恢复和神经再生,且Shh信号通路是否为该药物长时程应用的作用靶点。方法:采用永久性结扎右侧颈总动脉并在显微镜下烧灼右侧大脑中动脉的皮层分支以制备C57BL/6小鼠局灶性脑缺血模型(MCAO)。实验动物随机分为假手术组(Sham),梗死组(MCAO),小剂量用药组(Sals-L),大剂量用药组(Sals-H),抑制剂组(CYC),抑制剂+用药组(CYC+Sals)。各组小鼠分别于造模后24小时开始腹腔给予不同剂量的药物(15 mg/kg,30 mg/kg)或抑制剂(10 mg/kg),连续14天。分别于术后1、7、14、21、28天对各组小鼠进行Rotarod及m NSS神经功能评分,于28天用HE染色法测定脑梗死体积,于术后7、14、28天用免疫荧光染色测定神经再生相关指标(包括神经前体细胞的增殖、分化、迁移及少突胶质前体细胞的增殖、分化等的相关指标),于术后3、7、14天用免疫印记(Western blot)、实时荧光定量PCR(RT-q PCR)测定Shh信号通路上相关因子(Shh,Ptch,Gli1)及BDNF、NGF的蛋白及基因表达。结果:1注射用丹参多酚酸改善了脑缺血小鼠的神经功能对梗死组、小剂量用药组、大剂量用药组、抑制剂组、抑制剂+用药组组小鼠于术后1、7、14、21、28天进行Rotarod和m NSS神经功能评分。梗死后24小时,各组小鼠均显示了神经缺损症状,各组间神经功能学评分未见明显差异(P>0.05)。与梗死组相比,大剂量用药组的神经功能评分在14天(Rotarod)及21天(m NSS)明显改善,且持续到梗死后第28天,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与大剂量用药组相比,抑制剂组、抑制剂+用药组(剂量同大剂量用药组)的神经功能评分在14天(Rotarod)及21天(m NSS)明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),但两者与梗死组相比在任何时间点均无统计学差异(P>0.05)。2注射用丹参多酚酸对脑梗死体积无影响造模后第28天,Sham组脑组织未见梗死灶,用药组梗死体积较梗死组相比未见明显减(Sals vs.MCAO:11.39%±1.73%vs.11.60%±2.07%,P>0.05)。3注射用丹参多酚酸通过介导Shh信号通路促进脑缺血后神经再生Confocal结果显示,术后7、14、28天,用药组(之后实验中用药组剂量同大剂量用药组)同梗死组相比,梗死侧d SVZ区Brd U+细胞数及d SVZ区、v SVZ区DCX密度显著增多,且具有统计学意义(P<0.05),梗死对侧未见明显统计学差异(P>0.05),抑制剂+用药组同用药组相比在梗死侧上述指标均有显著性下降(P<0.05);DCX与Brd U共标表明梗死后神经再生,且造模后7、14、28天用药组DCX/Brd U共标细胞数占Brd U阳性细胞百分比较梗死组相比在梗死侧具有显著性增加,同时应用抑制剂则可逆转上述作用(P<0.05)。Confocal结果显示,在梗死灶周边的皮层和纹状体也可观察到DCX+细胞,说明神经前体细胞在梗死后发生了由SVZ区至梗死区的迁移。在梗死区域周边可以观察到Neu N、GFAP、Iba1与Brd U的共标,说明在脑梗死发生后神经前体细胞可以迁移至梗死区周边并分化成熟以取代受损的神经细胞。通过对神经前体细胞的荧光染色发现SVZ区的神经前体细胞具有很多分支,梗死后28天无论用药组还是梗死组DCX/Tuj-1共标均占很大一部分,但用药组DCX/MAP-2及DCX/SMI312共标数均较梗死组增多,说明药物可以促进神经前体细胞的突起向成熟的树突及轴突分化。此外我们还观察了SVZ区及胼胝体区少突胶质细胞的增殖及分化情况。结果表明,梗死后28天,在用药组梗死侧SVZ区NG2+细胞数较梗死组相比有增多,且具有统计学意义(P<0.05),此差异并未出现在梗死对侧(P>0.05)。无论在SVZ区还是梗死灶周边的胼胝体区域均可以观察到NG2/Brd U的共标。此外,梗死后28天,梗死灶周围胼胝体区用药组CNPase/Brd U共标细胞数占Brd U阳性细胞百分率较梗死组增加,具有统计学差异(P<0.05)。4注射用丹参多酚酸上调Shh、Ptch、Gli1的蛋白及基因表达,上调BDNF及NGF的表达Confocal结果显示DCX/Shh、Neu N/Shh、MAP-2/Shh、SMI312/Shh均有共标,且BDNF及NGF也均与DCX、Tuj-1、Neu N、MAP-2、SMI312共标。Western blot,RT-q PCR检测结果显示:梗死后3、7、14天,梗死组小鼠缺血侧脑皮层的Shh、Ptch、Gli1的水平上调,药物干预后,其水平较梗死组相比增多,且具有统计学意义(P<0.05),梗死对侧皮层上述指标未见明显统计学差异(P>0.05)。BDNF、NGF在梗死后第3天并未在用药组及梗死组之间出现统计学差异,而第7天及第14天,梗死侧皮层在用药组两者的表达同梗死组相比均具有统计学差异(P<0.05),梗死对侧无统计学差异(P>0.05)。Western blot结果显示:梗死后14天,抑制剂+用药组小鼠较用药组小鼠相比,shh信号通路上的指标Ptch及Gli1在梗死侧皮层的表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05),同时BDNF和NGF的表达在梗死侧皮层也下调,且具有统计学差异(P<0.05)。但Shh的表达无统计学差异(P>0.05)。结论:延迟性注射用丹参多酚酸治疗可显著改善脑缺血小鼠的神经功能,同时可促进梗死侧SVZ区神经前体细胞的增殖、分化、迁移及少突胶质前体细胞的增殖及分化,其机制可能是通过激活shh信号通路,从而上调BDNF、NGF的表达而诱导神经再生过程的。