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目的本研究旨在探讨细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)介导的 MAPK 通路在微囊藻毒素-LR(microcystin-leucine arginine,MC-LR)诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用以及MC-LR作用下ASK1的激活机制,为进一步探索MC-LR的生殖毒性提供新的研究思路,也为全面评估MC-LR诱导的的雌性生殖系统损伤提供参考依据。方法以6周龄雌性C57BL/6小鼠为动物模型,将小鼠随机分为4组,每组5只。不同浓度 MC-LR(0、40μg/kg·bw)、ASK1 抑制剂 NQDI-1(20 mg/kg·bw)以及 MC-LR 与 NQDI-1 联合(40 μg/kg·bw MC-LR+20 mg/kg·bw NQDI-1)注射14天后,检测小鼠血清中MC-LR含量;计算小鼠的性腺指数变化;苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,H&E)观察小鼠卵巢组织病理变化;TUNEL染色观察小鼠卵巢组织颗粒细胞凋亡率。以小鼠卵巢颗粒细胞KK-1为研究对象,设置对照组、MC-LR组(34μg/mL)、阴性对照(negative control,NC)组、NC+MC-LR(34μg/mL)组、siASK1 组和siASK1+MC-LR(34 μg/mL)组,培养细胞24 h后,检测细胞线粒体膜电位水平及细胞凋亡率;RT-qPCR和Western Blotting检测ASK1介导的MAPK通路中凋亡相关基因和蛋白的相对表达水平。为了分析MC-LR对ASK1转录水平的调控,根据ASK1的启动子序列在ALGGEN-PROMO网站上预测并筛选出ASK 1上游与凋亡有关的转录因子。KK-1细胞按照0,8.5,17,34μg/mL的浓度进行MC-LR染毒,RT-qPCR检测相关转录因子的mRNA水平。最后根据结果综合分析,筛选出ASK1上游最有可能的转录因子。为了分析MC-LR引起的氧化应激对ASK1磷酸化的调控,以KK-1细胞为研究对象,不同浓度MC-LR(0、34μg/mL)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)(10 mmol/L)以及 MC-LR 与 NAC 联合(34 μg/mL MC-LR+10 mmol/LNAC)染毒 24 h 后,Western Blotting 检测磷酸化 ASK1 蛋白的相对表达水平。结果MC-LR作用于青春期小鼠后,能够引起小鼠性腺指数降低以及卵巢组织发生病理损伤。而NQDI-1预处理后可以有效改善MC-LR引起的这些病理损伤变化,与单独染毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。另外,MC-LR还可以诱导小鼠卵巢组织凋亡细胞增加,而经过NQDI-1预处理的染毒组,凋亡细胞相对减少,与单独染毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。MC-LR可以引起KK-1细胞线粒体膜电位水平降低以及细胞凋亡率升高,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。而siASK1预处理后可以改善MC-LR引起的线粒体膜电位水平变化并且缓解由MC-LR诱导的KK-1细胞凋亡,与单独染毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。MC-LR作用下,凋亡相关基因JNK、P38、MEF2C、Fasl和DDIT3的mRNA水平升高,凋亡相关蛋白p-JNK、p-P38、Fas和P53的表达也升高。当有效抑制ASK1表达后,与单独染毒组相比,这些基因和蛋白的相对表达水平受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。通过对ASK1启动子的生物信息学分析,筛选出与凋亡有关的转录因子主要包括JunD、c-Jun、JunB和Nrf2。PCR结果显示MC-LR可以引起这些转录因子的mRNA水平升高。Nrf2和JunB的mRNA水平随着染毒浓度的增加而逐渐升高,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。根据以上结果以及以往研究结果,初步推断Nrf2参与MC-LR调控ASK1上调表达过程。MC-LR引起的氧化应激对ASK1磷酸化的调控研究结果显示,MC-LR处理组中磷酸化ASK1的相对表达水平远远高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);在抗氧化剂NAC预处理后的染毒组中,磷酸化ASK1蛋白表达水平与单独染毒组相比显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.MAPK信号通路参与了 MC-LR诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡过程,而ASK1是调控MAPK通路的关键位点。2.MC-LR可以分别从蛋白磷酸化和转录水平调控ASK1,进而激活MAPK通路。