论文部分内容阅读
本研究中,通过纳米沉淀法和脂质体挤压法制备出了叶酸修饰的红细胞膜包裹PLGA纳米粒（FA-RBCm-PLGA）药物载体,并负载紫杉醇（PTX）和第三代P-gp抑制剂Tariquidar（TQR）,以此构建一种同时具备肿瘤靶向和抗肿瘤多药耐药双重作用的新型纳米给药系统（FA-RBCm-PLGA-PTX-TQR）。该载药系统利用天然红细胞膜的安全性,叶酸配体的靶向性和TQR的抗肿瘤多药耐药特性,以望在降低毒副作用的前提下提高PTX的抗肿瘤效果,使癌症得到更有效的治疗。本文从载药系统的制备工艺、理化性质、体内药动学和体外抗肿瘤活性等方面进行评价,具体研究内容如下。采用纳米沉淀法制备PLGA-PTX纳米粒,并以包封率和载药量为指标,对药载比、油水体积比和超声强度这三个水平进行正交实验,确定最佳制备工艺。结果显示当药载比为1:5,油水体积比为1:5,500 W探头超声10 min时,PLGA-PTX纳米粒具有最佳的包封率和载药量。采用低渗裂解法提取得到RBCm,再通过脂质挤压的方法制备FA-RBCm-PLGA-PTX纳米粒。从包封率、粒径、电位和透射电镜下的形貌、体外释药特性等方面对PLGA-PTX和FA-RBCm-PLGA-PTX纳米粒进行表征和对比,同时考察FA-RBCm-PLGA-PTX的膜蛋白特性和储存稳定性。结果表明PLGA-PTX的包封率、粒径和电位分别为76.1%、138.7nm、-4.45 mV,FA-RBCm-PLGA-PTX的包封率、粒径和电位分别为67.6%、159.8 nm、-10.98 mV,且在透射电镜下两者都是粒径均一的球形颗粒。体外释放实验表明,与PTX游离药相比,PLGA-PTX和FA-RBCm-PLGA-PTX均能缓慢释放,但FA-RBCm-PLGA-PTX具有最明显的缓释特性。FA-RBCm-PLGA-PTX的膜蛋白种类与天然红细胞相比无明显减少,且稳定性良好,在4°C下保存21天粒径无明显增大。大鼠尾静脉注射FA-RBCm-PLGA-PTX,考察其在体内的药动学行为,结果显示FA-RBCm-PLGA-PTX组的AUC为6.025 mg/L·h,MRT为7.359 h,Cmax为3.328 mg/L,t1/2为5.837 h,与PTX相比具有较好的长循环特性。小鼠尾静脉注射FA-RBCm-PLGA-PTX,考察其在体内的组织分布情况,结果显示FA-RBCm-PLGA-PTX提高了药物在肝脏、脾脏、肾脏中的分布,且在12 h时药物含量明显高于PTX注射液,提示纳米混悬液组FA-RBCm-PLGA-PTX能延长药物在体内的滞留时间。采用纳米沉淀法和脂质体挤压法制备双载药的叶酸修饰红细胞膜包裹PLGA纳米粒（FA-RBCm-PLGA-PTX-TQR）,PTX和TQR的质量比为10:1,其他制备条件不变。MTT法检测FA-RBCm-PLGA-PTX-TQR的体外抗肿瘤活性,MCF-7/ADR细胞对纳米粒的摄取行为通过荧光显微镜和流式细胞仪从定性和定量两方面进行考察,并对摄取机制进行初步探索。结果表明FA-RBCm-PLGA-PTX-TQR、FA-RBCm-PLGA-PTX和RBCm-PLGA-PTX对于耐药细胞MCF-7/ADR的IC50值分别为17.88 μg/mL、39.52μg/mL和130.0μg/mL,提示叶酸靶向增加了细胞毒性,同时纳米粒中TQR的存在使其具有抗肿瘤多药耐药的效果,逆转倍数为2.21倍。叶酸抑制实验表明FA-RBCm-PLGA-PTX-TQR可通过叶酸配体受体特异性结合作用被MCF-7/ADR细胞摄取,摄取机制的初步探索表明其可通过网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞进入细胞,且这一过程受温度、细胞内ATP水平和pH值以及细胞膜流动性的影响。综上所述,双载药的FA-RBCm-PLGA-PTX-TQR纳米粒制备工艺稳定,安全性好,可延长PTX在大鼠体内的循环时间,提高在组织中的分布,同时具备肿瘤靶向性和抗肿瘤多药耐药特性,增强了治疗效果又降低了PTX的毒副作用,是一种性能优异有较好应用前景的纳米给药系统。