目的:世界卫生组织（WHO）下属的国际癌症研究机构（IARC）发布了 2021年全球癌症负担状况显示肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。从病理类型上,肺癌主要分为小细胞肺癌（约15%）与非小细胞肺癌两大（约85%）类型。虽然肺癌是所有肿瘤中治疗技术（靶向治疗、免疫治疗）或诊断手段（CT、痰细胞学检查）比较成熟,但肺癌仍然和其它癌种类似,5年生存率较低（约15%）。因此“三早”原则（发现、诊断和治疗）仍然是延长肺癌患者生存率的最佳方法。所以深入探索肺癌发生发展相关的分子机制,筛选特异性高、敏感性强的生物标志物仍是目前肺癌研究领域的热点和难点,为延长和改善肺腺癌患者生存具有重要的意义。近年来,长链非编码RNA（lncRNA）是新鉴定的一类不具有蛋白编码功能的RNA,长度≥200个核苷酸。临床和基础研究表明这些lncRNA在调节机体细胞的增殖、迁移、血管生成及免疫等多方面发挥重要的作用。lncRNA的异常表达通常与癌症的发生发展有显著相关性,并可以作为肿瘤早期诊断或靶向治疗的潜在标志物。因此,鉴定新的具有功能的lncRNA,并阐明在肺腺癌的发生发展过程中的具体功能及分子调控机制,为肺腺癌的早期诊断或治疗提供新的靶点。竹节香附素A（Raddeanin A,RA）是从毛茛科植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的根茎分离提取的一种具有抗癌潜力的三萜皂苷。研究表明,竹节香附素A具有抗肿瘤活性,如在小鼠模型中竹节香附素A能显著抑制骨肉瘤的生长。RA通过调节PI3K/AKT通路在体内外诱导人结直肠癌细胞凋亡和周期阻滞。此外,RA具有良好的抗肿瘤血管形成、侵袭、转移的特性。但关于RA是否能抑制肺腺癌细胞的增殖及分子机制目前还不清楚,因此评估RA抗肿瘤效果并阐明其抗肿瘤机制使其成为一个潜在抗肿瘤化合物提供理论实验依据。本研究旨在通过测序筛选肺腺癌组织中的新的lncRNA MNX1-AS1,通过分析其表达水平与肺腺癌患者预后相关性,并通过体外细胞和体内实验阐明该基因对肺腺癌细胞增殖和侵袭的影响及分子调控机制,同时阐明竹节香附素A对肺腺癌细胞增殖影响的分子机制。第一章lncRNAMNX1-AS1在肺腺癌组织中的表达与临床病理特性相关性分析目的:筛选肺腺癌组织中差异显著的新lncRNA,通过临床样本进行验证并分析其表达高低与临床病理特征的相关性方法:（1）收集5对肺腺癌组织和对应的癌旁组织,进行二代测序检测分析癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达谱,筛选显著差异的一个lncRNA（lncRNAMNX1-AS1）;（2）通过TGCA数据库分析lncRNAMNX1-AS1在肺腺癌组织中的表达及与患者生存期的关系;（3）通过qRT-PCR在40例肺腺癌组织样本中验证lncRNA MNX1-AS1的表达情况,同时,收集肺腺癌患者的临床病理信息,分析该基因的表达高低与肺腺癌患者临床病理相关性分析;（4）Kaplan-Meier生存曲线分析lncRNA MNX1-AS1表达高低与肺腺癌患者生存期的相关性;结果:（1）与癌旁组织相比,肿瘤组织中共有2642个lncRNA转录水平发生明显的改变,其中1007个lncRNA转录表达水平显著增加（P＜0.05）,1635个lncRNA转录表达水平显著降低（P＜0.05）,其中lncRNA MNX1-AS1（ENSG00000243479.3）在癌症组织中高表达,其平均表达是癌旁正常组织的6.8倍;（2）TCGA数据表明lncRNA MNX1-AS1在腺癌组织中高表达,而在鳞癌中却没有显著的变化。生存期分析显示,lncRNA MNX1-AS1高表达患者的生存期显著短于低表达的患者,因此可以作为判断患者预后的一个检测指标;（3）qRT-PCR检测结果显示lncRNA MNX1-AS1在肺腺癌组织（40例）的表达水平显著高于癌旁组织,进一步分析显示lncRNA MNX1-AS1与肺腺癌患者的性别、年龄,分化程度、吸烟史等不具有相关性,但与TNM分期（P=0.0154）和淋巴结相关转移（P=0.0321）具有显著相关性;（4）Kaplan-Meier生存曲线显示,lncRNA MNX1-AS1高表达组患者的总体生存周期显著低于lncRNA MNX1-AS1低表达组（P＜0.05）,其中低表达的中位生存期为55个月,而高表达的中位生存期为36.8个月;结论:在肺腺癌组织筛选到一种新lncRNA MNX1-AS1,该基因在肺腺癌组织中高表达并与患者临床病理特征具有相关性,lncRNA MNX1-AS1高表达预示患者生存期较短。第二章lncRNAMNX1-AS1靶向miR-527/BRF2通路调控肺腺癌细胞增殖与侵袭的分子机制研究目的:体外细胞功能实验检测过表达或敲低lncRNA MNX1-AS1对肺腺癌细胞增殖、克隆形成、周期、侵袭与迁移的影响,并探究lncRNA MNX1-AS1发挥功能的分子机制,并通过体内裸鼠成瘤实验进行验证。方法:（1）通过 qRT-PCR 检测 lncRNA MNX1-AS1 在 A549 细胞、H1299 细胞、H385细胞、PC-9细胞和人肺上皮细胞BEAS-2B中的表达水平。构建过表达lncRNAMNX1-AS1肺腺癌细胞系和敲低lncRNA MNX1-AS1的肺腺癌细胞系,（2）通过CCK-8实验、克隆形成实验和流式细胞仪检测过表达或敲低lncRNA MNX1-AS1对肺腺癌细胞的增殖、克隆形成能力和细胞周期分布的影响。（3）Transwell实验检测过表达或敲低lncRNAMNX1-AS1对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测过表达或敲低lncRNA MNX1-AS1对肺腺癌细胞内EMT 相关蛋白:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和 MMP-9 的表达。（4）RNA-FISH观察lncRNA MNX1-AS1在细胞质和细胞核中的定位,qRT-PCR检测lncRNA MNX1-AS1在细胞质和细胞核的含量比率;（5）在线生物学信息软件StarbaseV2.0和miRcode预测lncRNA MNX1-AS1调控的下游miRNA,qRT-PCR检测敲低lncRNAMNX1-AS1对下游靶miRNA表达的影响,荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉实验验证lncRNA MNX1-AS1与靶miRNA结合活性;（6）qRT-PCR检测miR-527在肺腺癌组织和癌旁组织中的表达情况,Pearson’s相关性分析肺腺癌组织中lncRNAMNX1-AS1与miR-527表达的相关性;（7）通过在线生物学信息软件检测StarbaseV2.0预测miR-527可能调控的下游靶基因,qRT-PCR检测过表达或抑制miR-527对下游靶基因表达的影响,荧光素酶报告基因验证miR-527与靶基因的结合活性;（8）Western blot检测BRF2在肺腺癌细胞中的表达情况,HPA数据库分析BRF2在肺腺癌组织和癌旁组织中的表达情况,克隆形成实验检测敲低或过表达BRF2对肺腺癌细胞克隆形成的影响;（9）Western blot检测 lncRNA MNX1-AS1、miR-527 对 BRF2 表达的影响,克隆形成和Transwell实验检测lncRNA MNX1-AS1通过miR-527/BRF2调控肺腺癌的增殖与侵袭;（10）体内致瘤实验检测敲低lncRNA MNX1-AS1对肺腺癌细胞在体内增殖能力的影响,qRT-PCR检测检测荷瘤组织中lncRNA MNX1-AS1和miR-527的表达,免疫组织化学检测裸鼠荷瘤肿瘤组织中BRF2和Ki-67的表达。结果:（1）qRT-PCR检测结果显示lncRNA MNX1-AS1在A549细胞和H385细胞高表达,在H1299细胞低表达,其中BEAS-2B细胞中表达最少,并在A549细胞中转染带有敲低lncRNA MNX1-AS1表达的慢病毒载体,在H1299细胞中转染过表达lncRNA MNX1-AS1慢病毒载体;（2）CCK-8和克隆形成实验结果显示,在A549细胞中,与shRNA control组相比,转染shMNX1-AS1后能显著抑制细胞的增殖和克隆形成能力（P＜0.05）,在H1299细胞,与过表达空白载体（pcDNA control）相比,转染MNX1-AS1过表达载体（pcDNA MNX1）后能显著促进肺腺癌细胞的增殖和克隆形成能力（P＜0.01）。流式细胞仪检测结果显示,在A549细胞中,与shRNA control相比,shMNX1-AS1能导致G0/G1期细胞比率从55.45±3.48%增加到72.54±4.53%,而相应的S期细胞比率分别16.07±2.48%降低到 11.96±2.57%,G2/M 期细胞比率从 24.04±3.21%降低到15.67±2.76%,在H1299细胞,与pcDNA control组相比,过表达MNX1能导致G2/M期细胞比率从23.44±3.37%增加到31.40±3.73%,相应的G0/G1期细胞比率从58.36±4.6%减少到46.26±3.78%,但是S期细胞比率有稍微的减少,但是无统计学意义;（3）Transwell 和 Western blot 检测结果表明,在 A549 细胞中,与 shRNA control组相比,shMNX1-AS1能显著上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin、Vimentin的表达进而抑制细胞侵袭与迁移能力,在H1299细胞,与pcDNA control组相比,pcDNA MNX1能显著下调E-cadherin的表达,上调N-cadherin、Vimentin表达促进细胞侵袭与迁移能力;（4）RNA-FISH检测结果显示:在A549细胞和H1299细胞中,lncRNAMNX1-AS1都主要定位在细胞质中,qRT-PCR检测结果显示约有78%的lncRNA MNX1-AS1分布在细胞质中;（5）在线生物学预测显示lncRNA MNX1-AS1下游miRNA,并取交集初步筛选出6个可能调控的miRNA,qRT-PCR、双荧光素酶活性实验和RNA免疫共沉淀实验证明lncRNAMNX1-AS1能与miRNA-527结合并调控其表达;（6）qRT-PCR检测结果miR-527在肺腺癌组织中低表达,并与lncRNAMNX1-AS1的表达具有显著的负相关性;（7）在线生物学预测并取交集显示有6个下游靶基因Sp1、SULF2、PHLPP2、BRF2、YWHAZ和Robo,过表达或抑制miR-527能显著调控BRF2的表达,双荧光素酶报告基因检测miR-527与BRF2具有结合活性;（8）Western blot检测显示,与正常肺上皮细胞相比,BRF2在肺腺癌细胞系H1299、A549、H358和PC-9中高表达。HPA数据库分析显示BRF2主要位于细胞核,在癌组织中BRF2的染色较深。过表达或敲低BRF2能显著影响肺腺癌细胞的克隆形成能力;（9）Western blot检测结果显示,与敲低空白对照组相比,shMNX1-AS1能显著抑制A549细胞中BRF2的表达,而在shMNX1-AS1组中转染miR-527 inhibitor能显著逆转敲低lncRNA MNX1-AS1对BRF2的抑制作用;在H1299细胞中,与过表达空白对照组相比,pcDNA MNX1能显著促进BRF2的表达,而在pcDNA MNX1组中转染miR-527 mimic能显著阻断过表达lncRNA MNX1-AS1对BRF2的促进作用;克隆形成和Transwell实验检测显示,与敲低空白对照组相比,shMNX1-AS1能显著抑制A549细胞中克隆形成和侵袭能力,而在shMNX1-AS1组中转染miR-527 inhibitor能显著逆转敲低lncRNA MNX1-AS1对细胞克隆形成和侵袭能力的抑制作用;（10）体内裸鼠致瘤实验表明敲低MNX1-AS1能显著抑制肺腺癌细胞在裸鼠体内增殖。qRT-PCR检测显示,与空白对照组相比,shMNX1-AS1组中lncRNA MNX1-AS1的表达水平显著降低,而miR-527的表达水平确显著升高,HE染色结果显示:在shRNA-Control组和shMNX1-AS1组的荷瘤组织中细胞核较大且不规则、核分裂象多且核形态不规则,符合肿瘤细胞的典型特征,免疫组化结果显示,在shRNA-Control组组织中Ki-67和BRF2染色较深,而shMNX1-AS1组组织中Ki-67和BRF2染色较浅。结论:体外细胞和体内成瘤实验证明lncRNA MNX1-AS1作为促癌基因,过表达则具有促进肺腺癌细胞增殖、克隆形成、侵袭与迁移能力,而敲低其表达能显著抑制肺腺癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭与迁移能力。分子机制研究显示lncRNA MNX1-AS1定位在细胞质,并通过miR-527/BRF2调控肺腺癌细胞的增殖与侵袭能力。第三章竹节香附素A（RaddeaninA）抑制肺腺癌细胞增殖的机制研究目的:探究竹节香附素A（Raddeanin A,RA）对肺腺癌细胞增殖能力的影响及调控的分子机制研究方法:（1）CCK-8 检测不同浓度（0、0.25μM、0.5μM、1.0μM、2.0 μM、4.0μM、8.0μM、16 μM、32 μM和64 μM）RA对肺腺癌肿瘤细胞系（A549细胞、PC-9细胞、H1299细胞和H358细胞）及肺正常上皮细胞（BEAS-2B细胞）活性的影响,并计算IC50 值;（2）通过 Hoechest33342 染色观察不同浓度（0、1.0μM、2.0 μM 和 4.0 μM）RA对肺腺癌细胞细胞核形态的影响,流式细胞仪检测RA对细胞凋亡率的影响;（3）通过Caspase（-3,-8和-9）活性检测试剂盒检测不同浓度（0、1.0μM、2.0μM和4.0 μM）RA对肺腺癌细胞内天冬氨酸蛋白水解酶活性的影响;（4）荧光显微镜观察不同浓度（0、1.0 μM、2.0μM和4.0 μM）RA对肺腺癌细胞ROS含量水平的影响,流式细胞仪分析RA对细胞内ROS含量的比率;通过CCK-8和Caspase-3活性实验检测用ROS的清除剂NAC在RA诱导肺腺癌细胞凋亡中的作用;（5）荧光显微镜观察不同浓度（0、1.0 μM、2.0 μM和4.0μM）RA对肺腺癌细胞内线粒体膜电位的影响,流式细胞仪检测RA对线粒体去极化的比率（6）qRT-PCR和Western blot检测不同浓度（0、1.0μM、2.0μM和4.0μM）RA对肺腺癌细胞内Bax和Bcl-2表达的影响;（7）Western blot检测不同浓度（0、1.0 μM、2.0 μM和4.0 μM）RA对肺腺癌细胞内Bax和Cytc在细胞质和线粒体中的影响;（8）Western blot检测ROS的清除剂NAC在RA诱导肺腺癌细胞内Bax和Bcl-2中的作用,流式细胞仪检测NAC在RA诱导肺腺癌细胞线粒体膜电位的影响;结果:（1）RA能抑制正常肺上皮细胞和肺腺癌细胞,正常肺上皮细胞24 h IC50为:16.23 μM,H358 细胞的 IC50:9.57 μM,PC-9 细胞的 IC50:3.47 μM,A549 细胞的IC50:6.62 μM,H1299 细胞的 IC50:5.72 μM;（2）Hoechest33342染色后,正常细胞细胞核着色分布均匀,细胞核呈球形或梭型,而RA处理后,2.0 μM处理24 h后,细胞核开始聚缩、变小,在显微镜下层亮蓝色,随着浓度的增大,到4.0 μM时,视野下的细胞核聚缩、变小显著增多,流式细胞仪检测分析。结果显示:2.0 μM和4.0μM的RA能显著促进PC-9细胞的凋亡;RA对Caspase-8的活性没有显著影响,而2.0 μM和4.0 μM的RA能显著激活Caspase-9的活性;（3）0μM和1.0μM RA处理后能细胞内的ROS水平没有显著影响,但是当浓度达到2.0μM和4.0 μM时,细胞内的ROS水平显著升高。NAC能显著逆转4.0 μM RA引起的细胞生长抑制,同时NAC能显著抑制4.0 μM RA激活的Caspase-3的活性;（4）荧光显微镜和流式细胞仪检测结果显示:0μM和1.0μM RA处理后能细胞线粒体膜电位水平没有显著影响,但2.0 μM和4.0 μM时,细胞线粒体膜电位水平开始显著降低。（5）Western blot检测结果显示:2.0 μM和4.0 μM的RA能显著上调促凋亡蛋白Bax的表达,而下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,并能显著促进Bax向线粒体膜转位,而Cyt c则由线粒体进入细胞质中;（6）ROS清除剂（NAC）能阻断RA对Bax促进作用,和对Bcl-2抑制作用,及线粒体膜电位降低。结论:RA能显著抑制肺腺癌细胞的增殖能力,其分子机制可能是通过上调细胞内ROS的水平,促进Bax的表达并促进Bax向线粒体转位,诱导线粒体膜电位降低,导致Cyt c进去细胞质诱导细胞凋亡。